枸杞籽油对亚急性衰老大鼠睾丸Nrf2/ARE通路和氧化损伤的影响

田瑞莹,邢莎莎,虎 娜,马文欣,刘 畅,刘自钰,马 彪,李佳阳,刘虎军,白长财,陈冬梅,马会明

(宁夏医科大学 1.生育力保持教育部重点实验室、2.基础医学院、3.临床医学院、4. 药学院、5.总医院宁夏干细胞与再生医学重点实验室, 宁夏 银川 750004)

枸杞(Lyciumbarbarum)是“药食同源”的道地药材,具有降血压、抗氧化、抗衰老等功效[1-2]。枸杞籽油(Lyciumbarbarumseedoil,LBSO),是枸杞籽经过CO2超临界萃取所得的一种功能油。已有报道LBSO可缓解UVB诱导的HaCaT的光损伤[3]、减轻氧化应激[4]、改善抑郁行为及认知功能障碍[5]。

机体衰老进程中伴随着器官功能的退化,其中睾丸的衰老可引起男性生殖功能障碍及相应症状,严重影响中老年男性的生活质量[6]。睾丸衰老时发生形态结构退行性病变,如睾丸重量减轻,生精细胞散在分布,支持细胞稀少,精子数目递减[7]。同时也伴随着睾丸功能的减退,如血清激素水平变化和精液质量(精子数量、精子活力)下降等[8]。研究证实衰老产生过多活性氧和自由基,引起机体氧化应激损伤,出现衰老[9],进而睾丸组织也会受到影响。已证实核转录因子E2相关因子2(NF-E2-ralated factor 2,Nrf2)/抗氧化反应元件(antioxidant responsive element,ARE)通路在维持机体细胞内氧化还原状态平衡和降低氧化应激造成损伤具有重要作用[10]。本课题组前期研究证实LBSO对D-半乳糖(D-galactose,D-gal)处理的衰老的睾丸支持细胞和衰老大鼠有明显的抗炎作用[11],但目前关于发挥抗衰老作用鲜有报道。因此本研究旨在探索LBSO是否可以通过Nrf2/ARE通路抑制亚急性衰老大鼠氧化应激和清除氧自由基,进而改善衰老或减缓衰老进程。

1 材料与方法

1.1 动物SPF级8周龄♂SD大鼠60只,动物许可证号：SCXK(宁)2020-0001,体质量(200±20)g,购自宁夏医科大学动物中心,实验动物福利伦理审查编号No. IACUC-NYLAC-2020-007,所有大鼠分笼饲养于湿度56%～65%,温度(20±3)℃的环境中,自由摄食和饮水。

1.2 药物LBSO执行标准：Q/QMSW0001S,购自宁夏杞明生物食品有限公司。

1.3 试剂D-gal(美国Sigma公司,货号：G0750,纯度>99%);盐酸二甲双胍片(metformin,Met;中美上海施贵宝制药有限公司,批号：国药准字H20023370,规格：0.5 g);β-半乳糖苷酶(β-gal)、Lamin B、β-actin、SOD2、NQO1以及GCLC抗体(北京博奥森公司,货号：bs-13369R、bs-1840R、bs-0061R、bs-20668R、bs-23407R、bs-23393R);p16INK4A、p21Waf1/CiP1和p53抗体(沈阳万类公司,货号：WL01418、WL0362、WL01919);Nrf2抗体(江苏亲科生物研究中心有限公司,货号：AF0639);GAPDH、山羊抗小鼠-IgG抗体和山羊抗兔-IgG抗体(北京Lablead公司,货号：G0100、S0100、S0101);γH2AX抗体(美国Cell Signaling Technology公司,货号：60566);蛋白电泳试剂(上海雅酶生物科技有限公司,货号：LK304);BCA蛋白定量试剂盒(凯基生物公司,货号：KGP902);细胞、组织核蛋白提取试剂盒(上海尚宝生物科技有限公司,货号：26131);ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,货号：E-OSEL-R0003、E-EL-0060c、E-BC-K030-M、E-BC-K022-M);通用二步法试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司,货号：PV-9000)。

1.4 仪器全自动冷冻研磨仪(JXFSTPRP-CL型);双目正置荧光显微镜(BX-51,日本奥林巴斯);蛋白电泳装置(Mini-PROTEAN Tetra型,美国Bio-Rad公司);全波长酶标仪(EPoch型,美国BioTek公司);化学发光凝胶成像仪(ChemiDoc XRS,美国 Bio-Rad公司);石蜡包埋机(KD-BM II型,中国KEDEE公司);石蜡切片机(RM2235型,德国Leica公司);切片扫描仪(APerio LV1型,德国Leica公司)。

1.5 实验方法

1.5.1动物分组以及处理方式 采用随机数字法,将大鼠分成空白对照组(Control)、模型对照组(Model)、LBSO低剂量组(1 000 mg·kg-1)、LBSO中剂量组(1 750 mg·kg-1)、LBSO高剂量组(2 500 mg·kg-1)和阳性药物二甲双胍对照组(Met,300 mg·kg-1),每组10只。除空白对照组,其他各组通过D-gal(125 mg·kg-1)颈部皮下注射8周,建立亚急性衰老模型,给药剂量按照本课题组文献[4]报道;在皮下注射4周时,LBSO低、中和高剂量组继续注射D-gal并同时灌胃LBSO 1 000、1 750、2 500 mg·kg-1,阳性药物对照组继续注射D-gal并同时灌胃二甲双胍300 mg·kg-1,灌胃共持续4周,至第8周注射D-gal和灌胃同时结束,开始取材收集各组睾丸组织和血清。

1.5.2血清氧化相关因子水平以及血清激素水平ELISA法测定 取大鼠心脏血液,室温静置30 min后,4℃条件下10 000 r·min-1离心15 min后取上清,采用ELISA法检测获得血清样品中氧化相关因子氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)以及激素睾酮(testosterone,T)、促卵泡激素(follicle stimulating hormone,FSH)和黄体生成素(luteinizing hormone,LH)的水平,按试剂盒说明书中的步骤进行标准品制备、加样、抗体孵育等操作,加入终止液后,酶标仪在450 nm波长下检测每孔吸光度值(A值)。

1.5.3HE染色观察大鼠睾丸组织的形态学变化 将取下的大鼠一侧新鲜睾丸立即置于4%多聚甲醛中固定24 h后,将睾丸取出,在睾丸中间以及睾丸两侧进行表膜扎孔以便固定液更好渗透进睾丸内部,再放入固定液中固定48 h后,经梯度乙醇、二甲苯脱水浸蜡后行石蜡包埋,制备成5 μm石蜡切片后,65 ℃烘烤3 h,切片脱蜡复水后,HE染色,乙醇脱水,二甲苯透明后中性树胶封片。光学显微镜下,观察睾丸组织的形态和结构的变化。

1.5.4免疫组织化学染色 将睾丸组织石蜡包埋切片后,进行脱蜡、复水、抗原修复、一抗孵育(Nrf2、GCLC、NQO1、SOD2、β-gal和γH2AX抗体稀释倍数均为1 ∶200)、二抗孵育、DAB显色、苏木精复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明后中性树胶封片。在光学显微镜下观察,可以看到组织内细胞呈现棕黄色或者是棕褐色,即为阳性表达区域。运用低倍镜和高倍镜调整观察染色情况。

1.5.5睾丸组织总蛋白和核蛋白提取 依据细胞、组织总蛋白和核蛋白提取试剂盒步骤,取50 mg经PBS润洗的睾丸组织,加入500 μL Hypotonic Buffer置冰上匀浆20次,收集匀浆,置4 ℃条件下12 000 r·min-1离心20 min后静置30 min,待分层后吸取上清至预冷的塑料管中,即为抽提得到的总蛋白。向沉淀中加入70 μL添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂Extraction Buffer高速剧烈涡旋,每隔1～2 min高速剧烈涡旋15～30 s,再置冰上孵育共30 min,后于4 ℃条件下12 000 r·min-1离心10 min后取上清,即为抽提得到的细胞核蛋白,用于Nrf2核蛋白分析和检测。

1.5.6Western blot检测p16INK4A、p21Waf1/CiP1、p53、γH2AX、GCLC、NQO1和SOD2总蛋白及Nrf2核蛋白水平 取上述提取的组织总蛋白和核蛋白,使用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。按照文献[9]的具体方法,蛋白变性SDS-PAGE电泳、转膜、室温封闭,加入一抗(p16INK4A、p21Waf1/CiP1、p53、γH2AX、GCLC、NQO1、SOD2)均(1 ∶1 000)、β-actin(1﹕5 000)和Nrf2核蛋白(1 ∶1 000)、核内参Lamin B(1 ∶2 000)4 ℃孵育过夜。加入对应二抗(1 ∶10 000)室温孵育1 h,后使用ECL发光液进行抗原抗体检测。用ImageJ对结果进行灰度值分析。每组实验重复3次。

2 结果

2.1 亚急性衰老模型大鼠的鉴定形态学结果显示,空白对照组大鼠睾丸组织中,精曲小管大小形状正常,管壁完整,内部各级生精细胞排列紧密整齐有序,精曲小管中心明显可见精子;衰老模型组睾丸组织中,精曲小管管壁扭曲变形,各级生精细胞排列稀松、疏散且无序,二者差异明显。免疫组化β-gal染色结果显示,与空白组相比,衰老模型组睾丸组织中β-gal阳性表达升高(Fig 1A)。与空白对照组比较,衰老相关蛋白p16INK4A、p21Waf1/CiP1、p53和γH2AX在衰老模型组的表达明显上调(P<0.05),差异有统计学意义(Fig 1B)。确定D-gal皮下注射成功制备了亚急性衰老大鼠模型。

2.2 LBSO对亚急性衰老大鼠睾丸组织形态学的影响与衰老模型组相比,LBSO各剂量组睾丸组织精曲小管管壁较完整,较相邻精曲小管联系紧密,形态未见明显扭曲,各级生精细胞排列较整齐有序,中心可见正常精子(Fig 2);间质细胞中β-gal表达阳性表达降低;支持细胞中γH2AX阳性表达降低(Fig 3-6)。

Fig 1 Identification of rats with subacute aging models n=3)

Fig 2 Effect of LBSO on testicular histomorphology in subacute aging rats (bar=50 μm)

Fig 3 Effect of LBSO on markers of testicular aging β-galactosidase in subacute aging rats (bar=50 μm)

Fig 4 Effect of LBSO on oxidative factor p16 in testis of subacute aging rats (bar=50 μm)

Fig 5 Effect of LBSO on oxidative factor p21 in testis of subacute aging rats (bar=50 μm)

Fig 6 Effect of LBSO on markers of testicular aging γH2AX in subacute aging rats (bar=50 μm)

2.3 LBSO对Nrf2蛋白表达的影响免疫组化结果显示,与模型组相比,LBSO各剂量组睾丸组织的支持细胞中Nrf2核表达阳性升高(Fig 7)。

Fig 7 Elevated expression of Nrf2 protein nuclei in testicular tissue of subacutely aging rats (bar=20 μm)

2.4 LBSO对Nrf2/ARE通路相关蛋白表达水平的影响Western blot结果显示,与衰老模型比较,LBSO各剂量组Nrf2/ARE通路相关蛋白Nrf2、GCLC、NQO1和SOD2的表达均明显上升(P<0.05),差异具有统计学意义(Fig 8)。免疫组化结果显示,与衰老模型比较,LBSO各剂量组Nrf2/ARE通路相关因子GCLC、NQO1和SOD2的表达水平阳性表达升高(Fig 9-11)。

Fig 8 Effect of LBSO on expression of Nrf2/ARE pathway correlated factors in testis tissue of subacute aging rats n=3)

Fig 10 Effect of LBSO on Nrf2/ARE pathway related factor NQO1 expression in testicular tissue of subacute aging rats (bar=50μm)

Fig 11 Effect of LBSO on Nrf2/ARE pathway related factor SOD2 expression in testicular tissue of subacute aging rats (bar=50μm)

2.5 LBSO对血清中氧化相关因子的影响ELISA检测氧化因子结果显示,与空白组相比,模型组血清SOD和GSH水平均明显降低,MDA水平明显增加(P<0.05),差异具有统计学意义;与模型组相比,经不同浓度LBSO和阳性药物Met干预后,血清中SOD和GSH水平均有明显升高,MDA水平明显降低(P<0.05),差异具有统计学意义(Tab 1)。

Tab 1 Detection of oxidation factor levels in serum of rats in each group after LBSO treatment n=10)

2.6 LBSO对各血清中激素水平的影响ELISA结果显示,与空白组相比,模型组血清T和FSH水平均有明显降低,LH水平明显增加(P<0.05),差异具有统计学意义;与模型组相比,经不同浓度经LBSO和阳性药物Met干预后,血清T和FSH水平均有明显升高,LH水平明显降低(P<0.05),差异具有统计学意义(Tab 2)。

Tab 2 Detection of hormone levels in serum of rats after LBSO treatment n=10)

3 讨论

睾丸作为对外源性因素极其敏感的组织器官,随着年龄的不断增加,其生殖生理功能逐渐衰退,随之也出现组织形态学和功能性的变化[12]。本研究采用D-gal制备的大鼠衰老模型,其睾丸组织形态学上出现生精细胞层数减少,各细胞之间的间隙变大,各级生精细胞都有不同程度的脱落,结果与李梦婷等[13]研究结果一致。HE与免疫组化结果显示,LBSO干预组睾丸组织精曲小管管壁较完整,较相邻精曲小管联系紧密,形态未见明显扭曲,各级生精细胞排列较整齐有序,中心可见正常精子;间质细胞中β-gal表达阳性表达降低;研究结果显示,模型组中衰老相关的生物标志分子p16INK4A、p21Waf1/CiP1、p53和γH2AX蛋白的表达明显上调,D-gal处理加速了衰老相关的生物学改变进程,这一亚急性衰老所致睾丸损伤结论与衰老相关生物学所述的损伤研究[14]的结论一致。p21是一种细胞周期调节因子,它处于p53上下游,可以透过与p53结合,控制损伤DNA的恢复和累积[15],作为细胞中感应DNA损伤最敏感的分子组蛋白变体H2AX(形成γ-H2AX)开始围绕损伤点聚簇。推测LBSO干预可能会降低机体及细胞的氧化损伤所致的衰老,进而保护睾丸损伤。睾丸组织各细胞也会因为D-gal处理出现适应性反应,出现组织或细胞衰老现象,导致细胞周期改变,产生细胞的氧化应激反应。组织或细胞中氧化酶SOD、GSH和MDA等和DNA的活性改变,进而生成大量超氧阴离子以及氧化产物,会造成生物大分子结构以及机体组织功能的损伤,最终引起机体以及细胞的老化[16]。本实验ELISA检测结果表明,LBSO治疗组和阳性药物治疗组血清SOD和GSH水平有明显上升,MDA水平明显下降。这与SOD和GSH抗氧化、抗衰老、清除自由基的生理功能,起到中和毒性的作用,MDA间接地反映膜脂过氧化程度的作用等[17]理论是相符的。同时,衰老过程中多种激素水平出现异常或者细胞对激素的敏感性亦有所降低。当LBSO和阳性药物治疗时,下丘脑分泌的促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)调控垂体LH的分泌,而LH可促进睾丸间质细胞合成和分泌睾酮[8],促进生精细胞的发生和发育,抑制生精细胞凋亡。分泌过多的睾酮可进入血液循环系统到达垂体抑制LH与FSH的分泌,部分经类固醇合成酶催化合成E2,后者再进行负反馈调节[18-19]。本实验研究结果显示,LBSO治疗组和阳性药物治疗组血清激素睾酮和FSH含量明显升高,LH含量明显降低。可能是因为LBSO通过下丘脑-垂体-性腺轴对睾丸的生殖功能发挥调节作用。Nrf2作为调控抗氧化反应和氧化损伤的一种关键转录因子[20],在诱导机体的抗氧化应答中起着重要作用,如调节氧化还原平衡、DNA修复和线粒体生理机能等。Nrf2通路的活化可上调多种抗氧化基因表达,降低组织氧化损伤[20]。在衰老过程中Nrf2通路以及靶基因均有表达降低的趋势,本研究结果显示,LBSO治疗组和阳性药物治疗组可明显提高亚急性衰老大鼠睾丸中Nrf2通路及其下游靶分子GCLC、SOD2和NQO1的蛋白表达水平,这可能是LBSO通过激活衰老睾丸组织中Nrf2通路,发挥抗氧化损伤的保护作用,进一步保护氧化损伤所致的睾丸组织衰老。综上所述,本研究通过成功构建亚急性衰老大鼠模型,观察到LBSO可以减轻亚急性衰老大鼠睾丸形态结构损伤,降低氧化应激,改善生殖激素的紊乱。LBSO可能是通过上调Nrf2信号通路及其下游GCLC、SOD2和NQO1的表达水平,达到改善衰老大鼠睾丸氧化应激的作用。本研究为LBSO保护睾丸、抵抗睾丸衰老、提高睾丸功能提供了一定的理论依据。但LBSO在衰老大鼠睾丸组织中发挥抗氧化应激作用,是否是直接激活Nrf2信号通路,是否是多靶点共同发挥作用,是否是通过其他通路共同发挥抗氧化作用,这些问题需要进一步深入开展研究。