槲皮素通过雌激素受体下调长非编码RNA MALAT-1并发挥抗乳腺癌的作用机制

赵梓亦,熊小明,谢雨鹏,张义文,张翠薇

(1.成都中医药大学附属医院中医药调节代谢性疾病四川省重点实验室,四川 成都 610000;2.西南医科大学附属医院病理科,3.重大疾病精准病理诊断泸州市重点实验室,4. 西南医科大学临床医学院,四川 泸州 646000; 5. 四川大学华西医院生物治疗全国重点实验室,四川 成都 610041)

乳腺癌是全球癌症发病率最高的癌种[1],大多数乳腺癌都是雌激素依赖性的,雌激素影响着乳腺癌的发生、发展、治疗及预后[2]。在雌激素发挥作用的复杂网络中,雌激素受体(estrogen receptor,ER)水平的高低是雌激素发挥作用的决定性因素[3]。因此,如何有效地将雌激素及其受体作为乳腺癌的治疗切入点越来越受到人们的关注。前期研究已发现,E2可以促进乳腺癌细胞转移相关肺腺癌转录因子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)的转录水平。MALAT-1是一种富含核的长非编码RNA,通常在患者肿瘤和转移灶中过表达。在乳腺癌中,MALAT1的过表达与肿瘤进展和转移呈正相关[4]。另一方面,我们还发现,槲皮素作为一种具有雌激素样活性的天然活性中药单体成分[5],对包括乳腺癌在内的多种与雌激素有关的恶性肿瘤均有一定的疗效,但作用机制并不十分清楚。本文通过研究槲皮素在经17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)处理的乳腺癌MCF-7和MB231细胞中的作用,并深入探寻其分子机制,期望为乳腺癌的中医药治疗探寻新的分子靶点,也为中医药治疗乳腺癌提供更多的理论依据。

1 材料与方法

1.1 中药筛选从APExBIO公司的天然化合物库(货号：L1039P)中筛选具有潜在抑制肿瘤细胞增殖能力的药物。即将潜在治疗药物按每个反应体系10 μmol·L-1加入到MCF-7细胞中,在24 h后观察细胞的生长状态,取细胞生长状态停滞,且细胞并未死亡的作用药物进行后续研究。

1.2 细胞系及主要试剂人乳腺细胞系MCF-7和MB231购自美国ATCC细胞库。DMEM培养基及胎牛血清购自美国Gibco公司,CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 细胞培养用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养MCF-7和MB231细胞,培养条件为37 ℃ 含5% CO2的细胞培养箱。

1.4 CCK-8细胞实验在96孔板中接种MCF-7细胞,培养过夜使细胞贴壁。在24、48、72 h分别加入10 μL CCK-8试剂,继续培养1 h。结束后,注意避光,并采用酶标仪检测450 nm处的吸光度(Absorbance,A)。每个组别设置3个复孔,检测细胞的增殖能力。

1.5 PI染色法检测细胞周期各组细胞处理后,用胰酶消化,收集细胞,75%乙醇4 ℃固定30 min,RNase去除RNA,避光条件下PI染色30 min,流式分析仪检测,每个样品收集1×104个细胞分析细胞周期。

1.6 平板克隆形成实验将MCF-7细胞接种于6孔板中,经胰蛋白酶消化、梯度倍数稀释后接种于培养皿中,培养14 d,经甲醇固定、Giemsa染色、计数,检测细胞的增殖能力。

1.7 构建过表达雌激素受体α(estrogen receptor-α,ERα)、MALAT-1慢病毒并转染乳腺癌细胞株依据ERα和MALAT-1的序列设计引物,扩增目的片段,再经切胶回收、双酶切后获得目的基因片段,质粒纯化并提取后行PCR和测序鉴定;将过表达质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,包装产生假病毒颗粒,完成过表达ERα、MALAT-1慢病毒的构建。用慢病毒LV-ERα、LV-MALAT-1分别转染乳腺癌MB231细胞和MCF7细胞,持续筛选获得稳定过表达ERα、MALAT-1的乳腺癌细胞株MB231-ERα和MCF7-MALAT-1。

1.8 Western blot检测肿瘤细胞中ERα蛋白表达收集转染后的MB231-ERα细胞株,提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,制胶、蛋白上样、电泳、转膜、封闭、一抗和二抗孵育,显影、定影、成像,用Image Lab 软件检测ERα 蛋白的表达。

1.9 RT-qPCR检测肿瘤细胞中MALAT-1表达细胞处理后,用1 mL TRIzol从5×106个细胞中提取细胞总RNA,并用100 μL去离子水溶解。将1 μg细胞总RNA以Oligo(dT)为引物逆转录为cDNA。以 β-actin 为内参基因,引物由广州复能基因有限公司合成,95 ℃预变性1 min后扩展并收集信号,每个检测进行3次重复,计算MALAT-1的相对表达量。

1.10 mRFP-GFP-LC3荧光双标腺病毒转染检测细胞自噬按照病毒感染复数于细胞培养基中加入病毒原液,将RFP-GFP-hLC3荧光标记的腺病毒转染导入外源性蛋白质,避光孵育2 h后,弃孵育液,更换细胞培养基,37 ℃、5% CO2培养箱中培养,于荧光显微镜下观察自噬小体及自噬溶酶体的数量。

2 结果

2.1 槲皮素对E2引起的MCF-7增殖促进具有逆转作用通过对天然化合物库中具有潜在肿瘤抑制活性的天然化合物进行筛选,我们发现槲皮素对MCF-7细胞的生长可能具有抑制作用。分别用1、2.5、5、7.5和10 nmol·L-1E2处理乳腺癌细胞MCF-7,并在1、2和3 d后检测细胞生长的变化,并发现5 nmol·L-1E2处理2、3 d后可以明显增加MCF-7细胞的增殖活性,差异具有统计学意义(Fig 1A,P<0.05)。接着在加入5 nmol·L-1E2同时,分别加入1、2.5、5和10 μmol·L-1槲皮素,观察细胞活力的变化。结果显示,5和10 μmol·L-1槲皮素明显抑制了雌激素对MCF-7细胞的促增殖作用,差异具有统计学意义(Fig 1B,P<0.05)。并且,单独加入5和10 μmol·L-1槲皮素对乳腺癌细胞的增殖活性没有影响。

Fig 1 Effect of E2 and quercetin on proliferation of MCF-7 cells by CCK-8

2.2 槲皮素对E2的抑制依赖于ERα表达接着,我们以不表达/微量表达ERα的乳腺癌细胞MB231为研究对象,通过慢病毒转染构建稳定过表达ERα的细胞株,来验证槲皮素的作用是否依赖于雌激素受体(Fig 2A)。我们发现,过表达ERα并未对MB231细胞周期产生明显变化(Fig 2B)。过表达ERα后,E2可以促进MB231-ERα的增殖活性(Fig 2C),但在加入槲皮素后,这种高增殖活性被逆转(Fig 2C,P<0.05)。这个结果说明,槲皮素对E2作用的抑制,依赖于ERα的表达。

Fig 2 Effect of over-expression of ERα on inhibitory effect of quercetin of MB231

2.3 槲皮素抑制雌激素所致的乳腺癌细胞MALAT-1上调,但不影响细胞自噬前期研究已发现,E2可以促进乳腺癌细胞MALAT-1的转录水平,于是我们用RT-qPCR检测了MALAT-1水平[6]。结果显示,在MB231-ERα 细胞中,E2组MALAT-1的转录水平明显增高,加入槲皮素可以明显降低MALAT-1的转录水平,差异具有统计学意义(Fig 3A,P<0.05)。由于MALAT-1与细胞自噬密切相关,我们用E2处理了稳定感染慢病毒mRFP-GFP-LC3的MB231细胞,并观察自噬线体的形成情况。如Fig 3B,E2处理可以明显增加GFP和mRFP共定位形成的颗粒信号,但槲皮素加入并未明显抑制颗粒信号的形成。

Fig 3 The possible mechanisms of quercetin′s anti-tumor effects on MB231

2.4 槲皮素抑制MALAT-1表达并抑制乳腺癌细胞的增殖能力为了检测槲皮素对细胞活力的抑制是否通过降低MALAT-1表达水平实现的,我们进一步以MCF7细胞株为模型,构建了过表达MALAT-1的肿瘤细胞,并在24、48 h检测细胞增殖能力变化。结果显示(Fig 4A,P<0.05),槲皮素逆转了E2对乳腺癌细胞促增殖作用,而过表达MALAT-1可以进一步促进细胞增殖,说明槲皮素可能主要通过抑制E2对MALAT-1的调控作用来影响了细胞增殖。为了确认这一潜在机制也出现在乳腺癌细胞的其他生物学行为上,我们进一步检测了细胞周期分布和克隆形成能力。结果与预期一致,在过表达MALAT-1后,槲皮素对细胞周期(Fig 4B)和克隆形成(Fig 4C)的影响均可被逆转。这说明5 μmol·L-1槲皮素对乳腺癌的影响,是通过抑制E2对MALAT-1的上调作用来实现的。

Fig 4 Effect of over-expression of MALAT-1 on

3 讨论

乳腺癌是雌激素依赖性恶性肿瘤,抑制雌激素作用下的癌细胞增殖是控制疾病进展、改善预后的关键[7]。雌激素是一种类固醇激素,包括雌酮(E1)、17β-雌二醇(E2)和雌三醇(E3),其中E2 在体内含量最丰富,作用最强[7],在各种生理和病理状态下发挥调控作用。因此,本研究选用E2处理乳腺癌MCF-7和MB231细胞。E2需与特定的ER结合方可发挥功能。雌激素核受体主要包括ERα和ERβ两种,由不同基因编码而成,因组织分布不同而存在功能上的差异[8]。大约70%的乳腺癌患者有ERα表达,且ERα信号失调是乳腺癌进展和内分泌抵抗的主要原因[9]。因此,我们构建了稳定过表达ERα的细胞株来验证槲皮素的作用是否依赖于ERα。

槲皮素结构与E2结构类似,是一种天然的植物雌激素[10],可以竞争性地与 ER 结合,进而诱导激素信号转导途径的改变,产生雌激素样作用[11]。本研究发现,槲皮素可以抑制E2对乳腺癌细胞的增殖促进作用,并证明了这种作用依赖于ERα的表达。但槲皮素结合ERα后激活雌激素受体通路的作用靶点及分子机制尚需进一步探寻。

Aiello等[12]通过染色质免疫共沉淀技术检测E2刺激后的乳腺癌细胞发现,雌激素受体的长链非编码RNA表达峰主要存在于MALAT-1、HOTAIR和ANRIL启动子区域上。其中,MALAT1是促进乳腺癌浸润和转移的主要非编码RNA。过表达的MALAT-1促进了乳腺癌干细胞的增殖、迁移和侵袭[13],并与乳腺癌的分化程度、大小和临床分期等临床病理学特征密切相关[14]。我们前期研究也证明,一定浓度的E2可以促进乳腺癌细胞MALAT-1的转录水平[6]。因此,我们检测了槲皮素和E2共同作用下乳腺癌细胞的增殖能力和MALAT-1的转录水平,结果与预期一致,槲皮素抑制了E2所致的MALAT-1过表达,进而抑制了乳腺癌细胞的增殖能力;过表达MALAT-1后,这种抑制作用被逆转。以上结果说明,槲皮素对乳腺癌细胞增殖能力的影响是通过结合ERα抑制E2,进而逆转了E2对MALAT-1的上调作用来实现的;并且,槲皮素降低了E2对MALAT-1的上调作用,这可能是槲皮素抑制乳腺癌恶性行为的分子机制。此外,为了进一步探索槲皮素抗乳腺癌的分子机制,我们还检测了E2作用下乳腺癌细胞的自噬水平,结果显示,槲皮素的加入并未改变乳腺癌细胞的自噬水平。

综上,槲皮素通过结合ERα抑制了E2对乳腺癌细胞的增殖促进作用,下调MALAT-1可能是槲皮素抑制乳腺癌细胞增殖的分子机制之一。槲皮素可以作为潜在的靶向ERα的抗乳腺癌药物,并在未来临床治疗上可能有更广阔的应用前景。