miR-141-5p/ZNF705A对慢性粒细胞白血病细胞源外泌体调控骨髓间充质干细胞黏附作用的机制

鲍 静,许 晗,汪万杰,许婷婷,戴霁菲,夏瑞祥

(安徽医科大学第一附属医院血液科,安徽 合肥 230032)

慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一种获得性血液系统恶性肿瘤,主要来源于骨髓造血干细胞的恶性增殖,约占新诊断成人白血病的15%[1]。随着CML发病机制的不断阐明,以酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)为代表的分子靶向治疗已成为CML的治疗首选。然而,研究发现仍有15%～25%的CML慢性期患者对TKIs耐药,加速期及急变期CML患者耐药率更高[2]。骨髓微环境是一种可以在空间意义上为造血干细胞提供庇护的复杂网状结构,其组成成分除造血干细胞外,还包括骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)、脂肪干细胞、成骨细胞、内皮细胞、成纤维细胞等非造血细胞和细胞外基质,以及多种细胞因子。在这些非造血细胞成分中,BMSCs占据主导地位,在骨髓微环境的黏附功能中发挥主要作用,能够促进造血干细胞的归巢和造血功能。严重的造血功能失调将会导致各种血液疾病,如再生障碍性贫血、CML等骨髓增生性疾病的发生[3]。然而,BMSCs在CML中的作用及机制仍未完全明确。

微小RNA(microRNA,miRNA)是由19～25个核苷酸组成的进化上保守的单链非编码RNA分子,在转录后水平调控基因的表达,参与肿瘤的发生发展。miRNA既可以作为癌基因促进癌症进展,也可以作为肿瘤抑制因子阻碍癌症进展[4-5]。目前,对参与CML中骨髓微环境黏附功能的miRNA仍知之甚少。

外泌体(exosome,Exo)是一类直径为30～120 nm的小的细胞来源囊泡,通过携带蛋白质、脂质、mRNA、miRNA、lncRNA或circRNA,参与细胞间通讯[6]。有研究揭示了CML细胞源Exo经miRNA调控BMSCs的黏附功能,在CML的发生发展中发挥重要作用[7]。课题组前期研究发现[8],miR-141-5p可能在CML中发挥抑癌基因的作用。本实验拟阐明miR-141-5p修饰的CML源性Exo对BMSCs黏附功能的影响及其调控机制,为CML治疗提供新的分子靶点。

1 材料

1.1 临床样本收集2021年1月-2021年12月安徽医科大学第一附属医院血液科病房和门诊初诊CML慢性期患者及健康人外周血标本,各20例,用于分离Exo;骨髓样本用于分离获得BMSCs。另外,收集健康志愿者脐带血,用于分离获得人脐血单个核细胞(human umbilical cord blood-mononuclear cells,HUCBMNCs)。参与本研究者均已签署书面知情同意书,本研究方案已获得安徽医科大学生物伦理委员会批准(No. 20200040)。

1.2 细胞株人慢性髓系白血病细胞株K562、人胚肾细胞株293T,均购自江苏无锡怀信生物。

1.3 主要试剂TRIzol、BCA蛋白定量试剂盒、RPMI 1640,均购自Biosharp公司;CD34+细胞分选试剂盒(货号：130-046-702),购自德国Miltenyi公司;Percoll分离液,购自北京索莱宝生物科技有限公司;无Exo胎牛血清(货号：C3801-0050),购自北京博迈德基因技术有限公司;Exo提取试剂盒(货号：KGPE001-10),购自南京凯基生物科技发展有限公司;Lipofectamine 2000(货号：11668-027),购自美国Invitrogen公司;双荧光检测试剂盒(货号：E1910),购自美国Promega公司;CCK-8试剂盒,购自日本同仁化学研究所;Annexin V-FITC/PI试剂盒(货号：KCD-T1004),购自上海科创达生物医药科技有限公司;一抗β-actin(货号：81115-1-RR)、Alix(货号：12422-1-AP)、CD63(货号：25682-1-AP)、CD29(货号：12594-1-AP)、CD45(货号：60287-1-Ig)、CD90(货号：27770-1-AP)、CD31(货号：11265-1-AP)、CD34(货号：14486-1-AP)、CD44(货号：15675-1-AP)、CXCL-12(货号：17402-1-AP),均购自武汉三鹰生物公司;一抗ZNF705A(货号：Y3715),购自美国lmmunoway公司。

1.4 仪器Microfuge 20R离心机(美国贝克曼公司);CYTATION 5全自动活细胞成像微孔板检测系统(美国BioTek公司);Axio Vert A1荧光倒置显微镜(德国Carl zeiss公司);Bioshine ChemiQ化学发光凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司);HITACHI HT7700电子显微镜(日本日立公司)。

2 方法

2.1 BMSCs与HUCBMNCs的分离培养采用Ficoll分离方法分离骨髓中的单个核细胞,使用含10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM高糖培养基重新悬浮细胞,调整细胞密度为5×108·L-1,然后将细胞接种于细胞培养瓶中进行原代培养,细胞在CO2浓度为5%,温度37 ℃的培养箱中生长。采用密度梯度离心法提取HUCBMNCs,以合适的浓度接种于细胞培养板中进行培养。

2.2 透射电镜鉴定Exo对收集的外周血血清与细胞培养上清液离心,除去细胞碎片等杂质。0.22 μm的滤膜过滤获得的上清液,然后超高速100 000×g离心1 h,弃上清。使用PBS缓冲液重新悬浮离心后的沉淀,再次离心,弃上清即获得Exo。将获得的Exo使用PBS重新悬浮后,保存于-80 ℃备用。将Exo点样到经formvar包被的copper grid(200目)上,2%多聚甲醛固定10 min,然后在无菌蒸馏水中洗涤,随后2%乙酸铀酰对比剂处理copper grid 15 min。在样品上滴加1滴0.13%的甲基纤维素与0.4%乙酸铀酰包埋样品,使用电子显微镜于80 kV条件下检测grid,并拍摄图片。

2.3 细胞转染取对数生长期的K562细胞或BMSCs,以1×108·L-1的密度分别接种至6孔板,每孔2 mL,每个浓度梯度3个复孔。利用Lipofectamine 2000转染试剂分别转染mimic NC、miR-141-5p mimic、inhibitor NC、miR-141-5p inhibitor,转染48 h后,细胞或上清用于后续实验。

2.4 CCK-8法检测细胞活性使用不同转染后K562细胞Exo处理BMSCs,分别在0、24、48、72 h时,于每孔中加入15 μL的CCK-8溶液,37 ℃、5% CO2培养箱中继续孵育2 h;酶标仪450 nm波长检测同一时间点吸光度(absorbance,A)值。

2.5 PKH67荧光染料标记CD34+与K562细胞Exo使用PKH67荧光染料标记Exo,观察BMSCs对Exo的摄取情况。吸取4 μL A液至1 mL稀释液C中制备染色工作液,混匀。提取的K562细胞Exo经PBS清洗后吸弃上清,加入1 mL稀释液C,轻轻重悬Exo,立即混匀,反应1～5 min。加入10 mL完全培养基终止染色,100 000 ×g离心1 h,吸弃上清,PBS清洗3遍,用5 mL完全培养基重悬清洗后的Exo,加入至对数生长期的BMSCs中继续培养。24 h后,弃上清,PBS洗涤细胞2次,DAPI复染细胞核,共聚焦荧光显微镜下观察,并保存图像。

2.6 萤光素酶实验检测miR-141-5p与ZNFs结合情况取对数生长期的293T细胞,调整细胞密度为5×107·L-1,接种至48孔细胞培养板,每孔300 μL,每个浓度梯度3个复孔。利用Lipofectamine 2000分别转染pmirGLO-ZNFs、miR-141-5p mimic,48 h后进行双萤光素酶检测。

2.7 qRT-PCR检测采用TRIzol试剂提取CML患者血清、细胞或骨髓组织的总RNA,使用逆转录试剂盒逆转录合成cDNA,使用SYBR Premix Ex Taq II进行qRT-PCR。所有操作严格按照试剂盒说明书执行。引物信息见Tab 1。

Tab 1 Sequences of primers

2.8 Western blot检测将细胞置于RIPA裂解缓冲液中充分裂解,于4 ℃、12 000 r·min-1将刮棒刮取的细胞离心5 min得到细胞总蛋白。使用BCA蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度,将蛋白样品煮沸10 min后,在SDS-PAGE凝胶上分离。转移至PVDF膜上,使用脱脂牛奶常温封闭1 h,加入一抗,4 ℃条件下与PVDF膜孵育过夜。次日,加入二抗与PVDF膜在室温下孵育1 h,ECL显影。

2.9 细胞黏附实验将BMSCs以1×105·L-1密度接种于培养皿中,至近60%融合时,加入Exo,48 h后进行黏附实验。分别取上述分离的HUCBMNCs,接种于上述BMSCs培养皿中,孵育2 h。PBS洗3次,洗去未黏附的细胞。结晶紫染色10 min、乙酸溶解,酶标仪测定A值。

3 结果

3.1 miR-141-5p在CML患者外周血Exo中低表达收集健康人与CML患者外周血,并分离Exo,经透射电镜和NTA分析发现,分离的Exo大小为150 nm左右(Fig 1A)。qRT-PCR结果显示,CML-Exo组Exo中miR-141-5p的含量与Normal-Exo组相比明显降低(Fig 1B)。Western blot结果表明,分离的样本表达Alix和CD63蛋白,证明为Exo(Fig 1C)。

Fig 1 Expression of miR-141-5p in Exo in clinical n=3)

3.2 K562细胞分泌的Exo鉴定及miR-141-5p在Exo中表达情况进一步收集K562细胞与健康人外周血CD34+细胞分泌的Exo,电镜检测及NTA粒径分析显示,分离的Exo大小为150 nm左右(Fig 2A)。qRT-PCR结果显示,K562-Exo中的miR-141-5p表达明显降低(Fig 2B)。Western blot结果显示,分离的样本表达Alix和CD63蛋白,证明为Exo(Fig 2C)。

Fig 2 Expression of miR-141-5p in n=3)

3.3 BMSCs分离、培养及Exo被BMSCs吞噬情况鉴定通过分离HUCBMNCs并诱导成BMSCs,Western blot结果显示表达CD29和CD90蛋白,不表达CD45、CD31和CD34蛋白,提示获得的是BMSCs(Fig 3A)。进一步qRT-PCR和Western blot结果显示,CML-BMSCs中CD44和CXCL12的表达明显降低(Fig 3B、3C),提示CML患者BMSCs的黏附功能降低。为了验证Exo是否被BMSCs吞噬,使用PKH67荧光染料标记CD34+与K562细胞Exo,发现Exo可被BMSCs吞噬(Fig 3D)。

Fig 3 Exo could be phagocytosed by n=3)

3.4 K562细胞源Exo能够降低CD34+细胞源Exo诱导BMSCs的黏附功能为了进一步探究K562细胞源Exo对BMSCs的黏附作用,将K562细胞和CD34+细胞分泌的Exo分别与BMSCs共培养。Western blot和qRT-PCR结果显示,BMSCs与CD34+细胞分泌的Exo共培养后,BMSCs中的黏附蛋白CD44和CXCL12的表达明显增高,且K562-Exo组能够降低CD34+-Exo组中黏附蛋白的表达(Fig 4A、4B)。CCK-8检测结果发现,Exo同样能够促进BMSCs活性,且CD34+-Exo组比K562-Exo组作用更明显(Fig 4C)。进一步黏附实验发现,Exo能够促进BMSCs的黏附,但K562-Exo组能够降低CD34+-Exo组中BMSCs的黏附能力(Fig 4D)。以上结果说明,K562细胞源Exo促进BMSCs的活性和黏附作用,但较CD34+-Exo组明显降低,提示K562细胞源Exo可能参与CML患者的骨髓造血功能。

Fig 4 Exo derived from K562 enhanced adhesion of n=3)

3.5 miR-141-5p与ZNF705A靶向结合使用TargetScan数据库发现,miR-141-5p与ZNF705A mRNA结合。进一步双萤光素酶结果显示,miR-141-5p可与ZNF705A的3′-UTR区域结合(Tab 2、Fig 5A)。Western blot和qRT-PCR结果表明,使用miR-141-5p mimic过表达BMSCs中miR-141-5p的表达可降低ZNF705A的mRNA和蛋白表达;miR-141-5p inhibitor抑制miR-141-5p的表达能够升高ZNF705A的mRNA和蛋白表达(Fig 5B、5C)。提示K562细胞源Exo中miR-141-5p通过调控BMSCs中ZNF705A的表达,参与BMSCs的黏附能力。

Tab 2 Paired genes displayed in results of dual luciferase

Fig 5 miR-141-5p targeted binding to n=3)

3.6 K562细胞源Exo通过miR-141-5p/ZNF705A调节BMSCs的黏附功能首先,采用PKH67荧光染料标记K562细胞源Exo,与BMSCs共培养,结果显示Exo被BMSCs吞噬(Fig 6A、6B)。qRT-PCR和Western blot结果显示,miR-141-5p mimic能够使K562细胞源Exo中miR-141-5p过表达,抑制BMSCs中ZNF705A的表达;miR-141-5p inhibitor能够抑制K562细胞源Exo中miR-141-5p的表达,促进BMSCs中ZNF705A的表达(Fig 6C、6E)。同时,miR-141-5p mimic促进黏附因子CD44和CXCL12的表达,而miR-141-5p inhibitor抑制其表达(Fig 6D、6E)。CCK-8实验结果显示,miR-141-5p mimic促进BMSCs活性,miR-141-5p inhibitor可抑制其活性(Fig 6F)。黏附实验证实,miR-141-5p mimic能够促进BMSCs的黏附功能,miR-141-5p inhibitor则抑制其黏附功能(Fig 6G)。进一步通过ZNF705A-siRNA沉默BMSCs中ZNF705A的表达,发现能够促进黏附因子CD44和CXCL12的表达(Fig 6H、6I)、BMSCs活性(Fig 6J)和黏附功能(Fig 6K)。提示可通过上调CML细胞源Exo中miR-141-5p水平,靶向抑制BMSCs中ZNF705A基因,进而促进BMSCs的活性和黏附功能。

Fig 6 Targeted regulation of ZNF705A by modulating level of miR-141-5p in CML exosomescould regulate adhesion function of n=3)

4 讨论

在骨髓微环境中,BMSCs作为非造血细胞的前体细胞,在造血干细胞的黏附、固定中发挥重要位点的作用[9]。有研究表明,减少CML患者的骨髓微环境中黏附分子CXCL12的表达,导致CML干细胞归巢和滞留的降低[10],揭示了造血干细胞在骨髓微环境中受到的归巢及黏附作用降低可能导致CML髓外浸润及骨髓移植治疗失败,改善这一现象可为治疗CML提供可能的新手段。

早期Exo被认为是细胞的“垃圾袋”以除去多余成分,然而,越来越多的研究表明,Exo参与微环境细胞与细胞之间的交流对话,在调节生理与病理过程中发挥重要作用。例如免疫细胞来源的Exo在介导细胞间通讯的同时,还可以参与机体免疫应答的调控,而来源于肿瘤细胞的Exo在肿瘤的发生、进展乃至致癌基因的转移过程中均发挥重要作用[11]。在既往的研究中发现,急性髓系白血病患者的血清中含有更高水平的Exo,其可以通过对免疫抑制细胞产生积极影响或对免疫细胞产生抑制作用,从而在癌症发展过程中起到关键作用。而在慢性淋巴细胞白血病中,Exo可以分泌一些白血病生长因子如IL-6、CCL2,以及与肿瘤进展相关S100-A9蛋白等,可促进疾病的进展。同样,Exo在血液系统恶性肿瘤中作为血管生成和转移介质的作用已被广泛研究,其被发现可以直接作用于血管内皮细胞,调节新生血管过程。除此以外,Exo还被发现可诱导血管生成,从而导致白血病进展,例如外泌体CLIC1可以通过调节ITGβ1-MAPK/ERK轴,促进HUVEC血管生成,从而加速转移和血管生成[12]。简而言之,白血病细胞来源的Exo含有促血管生成分子,通过血管生成,导致白血病细胞增殖和转移到远处组织。因此,Exo在白血病的发生、发展及转移等过程中均发挥着不可或缺的作用[13]。本文分别收集K562细胞、CML患者和健康人外周血细胞源Exo,与BMSCs共培养,结果显示,Exo可促进BMSCs活性和黏附能力;但与CD34+细胞源Exo组相比,K562细胞源Exo促进BMSCs活性和黏附能力的作用不够明显。Western blot和qRT-PCR分别检测细胞源Exo中miR-141-5p的表达水平,发现与健康对照相比,CML患者和K562细胞源Exo中miR-141-5p的表达明显降低,上调CML K562细胞源Exo中miR-141-5p的水平,可明显促进BMSCs的活性和黏附能力,下调miR-141-5p的表达,则会抑制BMSCs的活性和黏附能力。提示miR-141-5p可能通过修饰CML细胞源Exo,影响BMSCs的活性和黏附功能。

有研究揭示锌指蛋白可能通过调控肿瘤细胞黏附功能,参与疾病的发生发展[14-15],锌指蛋白家族成员ZEB1和ZDHHC5参与了BMSCs的分化、衰老等[16-17],锌指蛋白家族成员RNF6[18]等均参与了CML的发病。实验前期通过生物信息学预测发现,miR-141-5p能够与大量的锌指蛋白基因3′-UTR区域结合,其中ZNF705A结合分数最高,双萤光素酶基因报告实验进一步验证miR-141-5p与ZNF705A靶向结合,上调K562细胞源Exo中miR-141-5p水平,靶向抑制ZNF705A基因的表达,可增强BMSCs的黏附功能。以上均提示miRNA-141-5p修饰的CML细胞源Exo可能通过靶向调控下游的ZNF705A,参与BMSCs黏附功能的调节。

综上,本研究初步揭示了CML细胞源Exo中miR-141-5p调控BMSCs黏附功能的作用机制,从而改善CML骨髓造血功能,为CML治疗提供了新的有效的分子靶点与实验依据。