新型查尔酮衍生物MW-9抑制MAPK信号通路治疗小鼠溃疡性结肠炎

吴 招,邹楠婷,张春菲,张浩洪,莫庆艳,巨鸣谦,胥兴彩,毛泽伟,万春平,

(云南中医药大学1.中药学院、2.基础医学院、3.第三附属医院脾胃肝病科,云南 昆明 650500)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)临床上将其归类于慢性结肠黏膜炎症性疾病,临床表现主要为肠黏膜炎症引起的腹泻、腹痛及化脓性便血等。UC患者病情不稳定,常常复发交替[1]。对于UC的发病机制至今尚未明确,研究表明其主要与遗传因素、环境变化、免疫系统失调紊乱和体内肠道菌群微生物失调相关[2]。目前临床上治疗UC的药物主要为美沙拉嗪、柳氮磺吡啶、泼尼松以及单克隆抗体治疗,但治疗效果仍不理想。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)通路是细胞内信号转导的重要途径,广泛存在于真核细胞中,参与细胞分化、增殖、分裂和凋亡的调控[3]。细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)通路是MAPK的一条经典信号通路,除ERK1/2外,MAPK家族还有另外两个成员,即c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38,二者在促进细胞凋亡中起主要作用[4]。最新研究表明,MAPK信号通路与UC发病密切相关,其激活被认为是导致UC细胞因子和炎症介质释放的主要因素之一[5-6]。

查尔酮及其衍生物是一类存在于甘草、红花等药用植物中的天然有机化合物,表现出抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗菌和免疫调节等多种药理活性[7],特别是对T、B淋巴细胞等免疫细胞具有明显的作用[8]。为进一步提高查耳酮的抗炎免疫活性,基于构效关系研究,我们通过化学拼接的方法,将查耳酮和哌嗪环拼接合成一系列衍生物,并对这一系列衍生物进行抗炎、免疫活性筛选。前期研究发现,MW-9可明显下调脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导巨噬细胞RAW264.7炎症因子一氧化氮(nitric oxide,NO)、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)、IL-1β和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)的水平,提示MW-9体外具有良好的抗炎作用[9]。基于此,本研究通过构建巨噬细胞炎症模型和UC动物模型,以期揭示新型查耳酮衍生物MW-9抑制MAPK信号通路治疗UC的效应机制,为将MW-9开发为治疗UC的候选药物提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂新型查耳酮衍生物MW-9由云南中医药大学中药学院毛泽伟教授提供,纯度≥98%,黄色粉末,难溶于水。LPS(货号：L2880),购自美国Sigma公司;γ干扰素(interferon γ,IFN-γ)(货号：P01580),购自上海近岸蛋白质科技有限公司;葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium salt,DSS)(货号：160110),购自上海安倍医疗器械贸易有限公司;IL-6(货号：302971-003)、TNF-α(货号：348105-005)、IL-1β(货号：305457-003)的ELISA检测试剂盒,均购自赛默飞世尔科技中国有限公司;p38(货号：14064-1-AP)、p-p38(货号：28796-1-AP)、ERK1/2(货号：11257-1-AP)、p-ERK1/2(货号：28733-1-AP)、JNK(货号：51151-1-AP)、p-JNK抗体(货号：80024-1-AP),均购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2 仪器DMI3000倒置显微镜(德国Leica公司);SERIESⅡWATER JACKET细胞培养箱(德国Thermo公司);SepctraMax-i3X多功能酶标仪(美谷分子仪器上海有限公司);Chtmstudio多功能凝胶成像系统(美国UVP公司)。

1.3 细胞与实验动物小鼠巨噬细胞株RAW264.7,购自昆明动物研究所。SPF级C57BL/6J小鼠,♂,8周龄,体质量(22±2)g,购自北京斯贝福实验动物有限公司,动物生产许可证号：SCXK(京)2019-0010。小鼠饲养于云南省中医医院中心实验室屏障动物房,温度(25±2)℃,湿度(55±5)%,自由饮水饮食。

1.4 方法

1.4.1细胞培养 用含10%胎牛血清的DMEM培养液,于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养RAW264.7细胞。

1.4.2MTT法检测MW-9对细胞活性的影响 RAW264.7细胞培养至80%左右,PBS清洗,0.25%胰酶消化后,细胞浓度调至5×108·L-1,加至96孔细胞培养板中。设对照组与MW-9干预组(1.5、3、6 mg·L-1),继续培养24 h后,每孔加入20 μL的MTT,于37 ℃继续培养2 h,离心,弃上清,每孔加入150 μL DMSO,振荡,酶标仪570 nm处检测吸光度。

1.4.3Griess试剂法检测MW-9对细胞培养上清中NO含量的影响 RAW264.7细胞浓度调为2×109·L-1,加至96孔细胞培养板,设不刺激对照组、刺激对照组(10 mg·L-1LPS+5 g·L-1IFN-γ)及药物干预组(1.5、3、6 mg·L-1)。37 ℃继续培养24 h,取细胞培养上清,检测NO含量。将NaNO2标准品梯度稀释,与待测培养上清液分别加至96孔板中,每孔100 μL,Griess试剂加至96孔板中,每孔100 μL,酶标仪540 nm处检测吸光度,根据标准曲线计算NO的含量。

1.4.4ELISA法检测细胞因子水平 细胞分组同“1.4.3”,在37 ℃、5 % CO2细胞培养箱培养48 h,收集培养上清。按照试剂盒说明书检测细胞培养上清中IL-6、TNF-α、IL-1β的水平。

1.4.5实验动物分组及UC小鼠模型的构建 小鼠适应性饲养1周后,根据体质量随机将小鼠分为正常对照组、模型组、MW-9低剂量组(20 mg·kg-1)、MW-9高剂量组(40 mg·kg-1),每组8只。药物溶于羧甲基纤维素钠中,制备成混悬液,给药剂量参照MW-9治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠的剂量[9]。本实验方案通过云南省中医医院动物伦理委员会审查(编号：DW2022-015)。小鼠分组后,给予3% DSS溶液喂养,正常对照组给予等量纯净水,给药组造模的同时给予MW-9药物干预,造模持续10 d,造模d 1开始给药。

1.4.6实验动物数据的记录与收集 造模给药开始后,每天记录小鼠体质量及饮水量变化。造模结束后,小鼠眼球取血,颈椎脱臼处死后,取结肠并进行评分,结肠评分标准参照：0分=结肠黏膜正常;1分=结肠黏膜局部充血,无溃疡及坏死;2分=结肠黏膜充血并局部坏死;3分=结肠黏膜有多处充血和坏死;4分=沿肠壁多位点充血溃疡范围>1 cm,同时测量结肠长度和重量。

1.4.7HE染色 取结肠固定于10%福尔马林固定液中,用不同浓度乙醇对标本进行脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切成4 μm薄片,苏木精-伊红染色,封边观察。病理评分标准如下：0分=正常,无炎症迹象;1分=低白细胞浸润;2分=中度白细胞浸润;3分=高白细胞浸润,中度纤维化,结肠壁增厚,中度杯状细胞丢失,局灶性隐窝丢失;4分=白细胞透壁浸润,杯状细胞大量丢失,广泛纤维化,弥漫性隐窝丢失。

1.4.8ELISA检测血清细胞因子水平 末次给药后,小鼠眼眶取血,离心吸取上清,按照试剂盒说明书测定IL-6、TNF-α和IL-1β水平。

1.4.9Western blot检测蛋白表达 称取50 mg结肠组织,加入RIPA组织裂解液和蛋白酶、磷酸酶抑制剂,离心取上清,BCA蛋白定量,变性后保存备用。电泳,转膜,奶粉封闭后,加入p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK抗体孵育过夜,清洗后加入二抗孵育2 h,清洗后显影。运用ImageJ软件分析处理蛋白条带。

1.4.10统计学分析 所有数据采用GraphPad Prism、SPSS 22.0软件进行统计分析。采用两个独立样本t检验来确定两组之间的差异,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MW-9对RAW264.7细胞产生NO的影响如Fig 1所示,查耳酮衍生物MW-9在6 mg·L-1浓度范围内不影响RAW264.7细胞活性。与刺激模型组相比,MW-9干预后明显抑制RAW264.7细胞NO的产生,其半数细胞抑制浓度(IC50)为20.47 mg·L-1。

Fig 1 Cytotoxicity and NO concentration of chalcone derivative MW-9 on RAW264.7 n=3)

2.2 MW-9对RAW264.7细胞炎症因子产生的影响ELISA实验结果表明(Fig 2),与刺激模型组比较,MW-9组TNF-α和IL-1β浓度明显下降(P<0.01),MW-9(1.5、3 mg·L-1)还能明显抑制IL-6的产生。提示查耳酮衍生物MW-9具有较好的抗炎活性。

Fig 2 Effects of MW-9 on TNF-α (A), IL-6 and IL-1β (B) levels in RAW264.7 cell culture n=3)

2.3 MW-9对UC小鼠体质量和结肠的影响Fig 3结果显示,与正常对照组比较,模型组小鼠体质量下降明显,结肠长度缩短、重量下降;MW-9干预后,延缓UC小鼠体质量下降和结肠缩短,差异均具有统计学意义。

Fig 3 Effects of MW-9 intervention on mice with ulcerative n=8)

2.4 MW-9对UC小鼠结肠病理损伤的影响HE染色结果显示(Fig 4),与正常对照组比较,模型组小鼠结肠黏膜局部充血,肠壁增厚,细胞排列混乱,有多处溃疡及坏死。与模型组比较,MW-9组小鼠结肠黏膜细胞排列较为整齐,肠壁增厚不明显,仍有局部充血、部分溃疡以及坏死,其中MW-9高剂量组效果最佳。组织学评分显示,与模型组比较,给药组小鼠结肠病理组织学评分明显降低(P<0.01)。

Fig 4 Effect of MW-9 on histopathological changes in colon of mice with ulcerative n=8)

2.5 MW-9对UC小鼠炎症因子产生的影响ELISA结果显示(Fig 5),与正常对照组比较,模型组小鼠血清炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β水平明显升高;与模型组比较,MW-9低、高剂量组小鼠血清TNF-α、IL-1 和IL-6水平均不同程度降低。

Fig 5 Changes in levels of TNF-α, IL-1β (A) and IL-6 (B) in mice after MW-9 n=8)

2.6 MW-9对UC小鼠结肠MAPK信号分子表达的影响如Fig 6所示,与正常对照组比较,模型组结肠p38 MAPK和ERK1/2蛋白表达水平明显增加;MW-9干预后明显抑制MAPK信号中p38 MAPK和ERK1/2蛋白磷酸化水平,而对JNK蛋白磷酸化水平无明显的作用。

Fig 6 Effect of MW-9 on MAPK signaling pathway in mice with ulcerative n=3)

3 讨论

天然的查耳酮化合物广泛分布在自然界的植物中,其母核结构为1,3-二苯基丙烯酮。查耳酮母核是一类非常重要的有机合成和药物合成结构,具有较大的分子柔性,可以结合不同的受体,因此查耳酮衍生物种类结构众多且各有特点[10]。哌嗪环是重要的医药中间体,在药物分子中是被广泛应用的杂环结构之一,具有高活性、低毒性的特点,哌嗪环上的N原子可以参与生物体中氢键的形成,增加药物与受体的亲和力和选择性,使得该类化合物在新药研究方面具有重要的作用[11]。基于此,我们创新性地将查耳酮和哌嗪环进行化学拼接,得到一系列的新型查尔酮衍生物。经抗炎活性的筛选,这类衍生物体外表现出良好的抗炎活性。在MW-9干预RAW264.7细胞炎症模型后,其对细胞NO的产生具有明显的抑制作用,并明显抑制TNF-α的产生。此外,数据表明MW-9给药后可以通过抑制致病性Th17细胞,减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎,且明显抑制IL-17在CD4+T细胞中的表达和Th17细胞的体外分化[9]。然而,MW-9对UC的疗效尚不明确。

炎症是一个复杂的过程,当机体受到感染、损伤或刺激时,免疫细胞受到刺激后,细胞膜上的受体与相应配体结合,触发核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)、MAPK等信号转导反应,最终导致炎症因子的基因转录和表达增加。RAW264.7细胞在LPS和IFN-γ的联合刺激下,产生大量促炎介质和炎症因子,主要的促炎介质为NO、TNF-α、IL-1β、IL-6等,这些细胞因子参与了炎症相关疾病的发病过程[12]。基于此,抑制这些促炎细胞因子的过度分泌可能是对抗炎症反应的重要手段。本研究利用LPS和IFN-γ联合刺激RAW264.7细胞,构建体外细胞炎症模型,查尔酮衍生物MW-9干预后可明显下调RAW264.7细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6水平,提示MW-9在治疗炎症性疾病方面具有一定应用前景。

炎症反应和氧化应激是UC进展和恶化的主要原因[13]。近年来研究发现,MAPK信号通路在UC发病进程中具有关键作用,是与肠道损伤相关的主要信号转导途径[14]。MAPK途径的激活涉及JNK、ERK和p38的磷酸化,进一步激活细胞核中的转录因子。ERK、JNK和p38被认为是MAPK的主要激酶,它们可以被多种细胞因子、激素和蛋白质诱导。p38是介导UC的重要通路,可被多种细胞因子激活,如激素、IL-1β、TNF-α等[15]。p38可使TATA结合蛋白在下游NF-κB复合体中磷酸化,调控NF-κB的转录活性,进而调控炎症反应[16]。ERK被激活后,可调控下游靶标NF-κB、Bcl-2等,从而影响炎症反应和细胞凋亡[17]。JNK在炎症、氧化应激和其他过程中起调节作用,其中IL-1β可以激活JNK并参与炎症反应[18]。Western blot检测结果显示,MW-9干预明显抑制MAPK信号通路中p38 MAPK和ERK1/2蛋白磷酸化水平,提示MW-9可能通过抑制MAPK信号通路治疗UC,确切的作用机制需要进一步确证。该研究为将新型查尔酮衍生物MW-9开发成治疗炎症性疾病的药物奠定了实验基础。