基于TGF-β1/Smads信号通路探讨2-十二烷基-6-甲氧基-2,5-二烯-1,4-环己二酮抗肝纤维化的作用机制

黄 湘,方坤凤,范氏泰和,梁杏梅,黄仁彬,李学政

(1.广西卫生职业技术学院,广西 南宁 530023;2.广西平南县妇幼保健院,广西 平南 537300;3.广西中医药大学附属国际壮医医院,广西 南宁 530001;4.广西医科大学药学院,广西 南宁 530021)

肝纤维化是肝脏受到多种因素慢性刺激后发生的一种保护性修复反应,是肝炎进一步发展的必经之路,同时其进一步发展可演变为肝硬化,甚至肝癌[1-2]。导致肝脏损伤的因素有病毒、酒精、化学物质、寄生虫等。肝脏损伤如得到及时终止,肝脏可恢复正常或形成的肝纤维化可逆转,但是如果持续刺激,肝纤维化难以逆转并进一步发展为肝硬化或肝癌[3-4]。因此肝纤维化是肝脏损伤修复失衡的结果,减轻或逆转肝纤维化过程可以有效预防肝硬化和肝癌的发生。

杨桃根(AverrhoacarambolaL.)为醡浆草科多年生植物,根可入药。前期本课题组研究发现,杨桃根提取物对四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)诱导小鼠急性肝损伤及大鼠肝纤维化具有保护作用[5-6]。然而其中有效作用成分未知,为进一步探究杨桃根提取物中有效抗肝纤维化作用的成分,本研究拟对杨桃根醇提取物中单体化合物2-十二烷基-6-甲氧基-2,5-二烯-1,4-环己二酮(2-dodecyl-6-methoxycyclohexa-2,5-diene-1,4-dione, DMDD)进行验证,探讨其对肝纤维化的影响及潜在作用机制[7]。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂SD大鼠,SPF级,雄性,体质量(180±20)g。购买于具备合格实验动物生产许可证和使用许可证的广西医科大学实验动物中心,并饲养于标准实验室中。实验动物生产许可证：SCXK桂2014-0002,实验动物使用许可证：SYXK桂2014-0003。DMDD自行提取,纯度为96.7%。秋水仙碱(广东彼迪药业有限公司)、CCl4(分析纯AR,阿拉丁公司)、通用SP试剂盒(小鼠/兔链霉卵白素-生物素法检测系统,北京中杉金桥生物技术有限公司)、免疫组化抗原修复缓冲液(粉剂型柠檬酸法)(迈新试剂生物试剂有限公司)、门冬氨酸转移酶(aspartate transferase,AST)、丙氨酸转移酶(alanine transferase,ALT)、白蛋白/球蛋白(albumin/globulin, A/G)、总蛋白(total protein,TP)、总胆红素(total bilirubin,T-BIL)、总蛋白定量测定试剂盒(BCA法)试剂盒(南京建成生物工程研究所),大鼠透明质酸(hyaluronic acid,HA)、层粘连蛋白(laminin,LN)、Ⅲ型胶原(collagen type Ⅲ,ColⅢ)和Ⅳ型胶原(collagen type Ⅳ,ColⅣ)试剂盒(上海源叶生物科技有限公司),鼠抗Ⅰ型胶原(collagen type Ⅰ,ColⅠ)抗体(Abcam公司),鼠抗转化生长因子β1(transformed growth factor β1,TGF-β1)、兔抗Smad 2、兔抗Smad 4抗体(Cell Signaling Technology公司),鼠抗α平滑肌肌动蛋白(α smooth muscle actin,α-SMA)抗体(Merck millipore公司),鼠抗Smad 7抗体(Santa Cruz Biotechnology公司),RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR试剂盒[TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司]。

1.2 仪器PCR仪、实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystem 公司),显微镜(OLYMPUS,BX53),病理组织包埋机(上海莱卡仪器有限公司),酶标仪(Thermo Fisher Scientific公司),高速低温离心机(Eppendorf, 5810R),匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司),电热垂直电泳仪、转膜仪(Bio-RAD公司),化学发光成像系统(北京赛智创业科技有限公司)。

1.3 动物分组、给药方法及模型建立取70只大鼠,雄性,SPF级,体质量(180±20)g,适应性喂养1周后,随机平均将大鼠分为I-V组。其中第I组给予橄榄油,其他组给予50% CCl4造模,剂量均为1 mL·kg-1,每周2次。期间在第6～8周分别随机各取1只大鼠做肝纤维化检测。第9周开始给予药物干预,阳性对照组给予秋水仙碱(0.2 g·kg-1),DMDD分为高剂量组(25 mg·kg-1),低剂量组(6.25 mg·kg-1),各组给药容积均为10 mL·kg-1,每天灌胃给药1次,共4周[8]。正常对照组按等体积给予生理盐水作为对照。给药期间同法造模。

1.4 标本采集采用水合氯醛麻醉后,经腹主动脉采集大鼠血液。颈椎脱臼处死后采集肝脏、脾脏、胸腺。将血液静置后分离血清,分装后低温保存。内脏漂洗后,拭干,称质量。取部分肝组织固定于甲醛溶液中,其余分装后于-80 ℃环境保存。

1.5 指标检测

1.5.1血清生化指标测定 麻醉大鼠后,经腹主动脉采血,收集血液。将收集的血液置于室温静置1 h,4 ℃, 3 000 r·min-1离心10 min,取上清液。采用赖氏法检测血清AST、ALT、A/G、TP、T-BIL。采用ELISA法检测HA、LN、ColⅢ、ColⅣ。

1.5.2肝组织病理检查 肝组织经甲醛固定24 h后,常规脱水,石蜡包埋,切片,行HE和Masson染色。

1.5.3RT-PCR法检测肝组织中α-SMA、ColI、TGF-β1、Smad7 mRNA的表达 按RT-PCR检测试剂盒检测肝脏组织中α-SMA,ColI、TGF-β1、Smad7 mRNA的表达。

1.5.4免疫组织化学法检测肝脏组织相关蛋白表达 肝组织经甲醛固定24 h后,常规脱水,包埋,切片,烤片,静置至室温。按照免疫组化染色步骤滴加一抗(稀释比例α-SMA、ColI、Smad2为1 ∶500,TGF-β1为1 ∶1 000、Smad7为1 ∶100),4 ℃孵育12 h,PBS冲洗3次后孵育二抗1.5 h(稀释比例1 ∶5 000),PBS冲洗3次后染色,清洗后烘干即可封片。

1.5.5Western blot法检测肝脏组织中TGF-β1,Smad4,Smad7蛋白表达 每组随机取3个样品肝组织适量,冰上研磨,制备10%肝组织液,分离后提取蛋白,备用。经制胶,电泳、转膜、封闭、免疫反应(TGF-β 1稀释比例1 ∶1 000,Smad4稀释比例1 ∶1 000,Smad7稀释比例1 ∶100),4 ℃孵育过夜,用5%脱脂牛奶稀释二抗(稀释比例1 ∶5 000),常温孵育1 h,扫膜、密度分析。

2 结果

2.1 大鼠的一般情况大鼠适应性喂养期间,状态良好,体质量增加。建立肝纤维化模型后,与正常对照组相比,模型组大鼠精神萎靡、反应迟钝、毛发暗淡。给予DMDD治疗后,与模型组相比,DMDD给药组大鼠精神较活跃,活动较丰富,毛发光泽度更高。

2.2 血清生化指标结果由Tab 1可知,与正常对照组相比,模型组大鼠肝脏AST、ALT、TP、T-BIL明显升高(P<0.01),A/G明显降低(P<0.01)。与模型组对比,DMDD给药组AST、ALT、TP、T-BIL明显降低(P<0.01或P<0.05),A/G明显升高(P<0.01或P<0.05),差异具有统计学意义。

Tab 1 Effects of DMDD on ALT, AST, A/G, TP, T-BIL n=10)

2.3 血清HA、LN、ColⅢ、ColⅣ水平的影响由Tab 2可知,与正常对照组相比,模型组HA、LN、ColⅢ、ColⅣ水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比,DMDD给药组HA、LN、ColⅢ、ColⅣ水平明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。

Tab 2 Effects of DMDD on HA, LN, ColⅢ、ColⅣ n=10)

2.4 肝脏组织病理检测和Masson染色结果Fig 1为肝脏病理HE和Masson染色结果,正常组大鼠肝细胞排列整齐,肝索呈星状排列,肝小叶结构完整,肝窦周围无充血、出血、水肿现象,肝间质无炎症细胞浸润,汇管区无纤维组织增生。模型组大鼠肝小叶结构损坏明显或消失,肝索排列紊乱,肝细胞肿胀、空泡气球样变型、坏死、结构紊乱。汇管区及中央静脉区纤维结缔增生明显,条索粗大,相互连接成为纤维间隔。肝小叶不同程度坏死,伴随炎症细胞浸润。DMDD给药组大鼠肝纤维结缔增生明显减少,纤维条索明显变窄,纤维间隔较少。肝细胞水肿明显好转,炎症浸润明显减轻,排列较整齐,结构无明显改变。肝小叶结构较完整,肝索排列较为整齐。

Fig 1 HE staining and Masson staining of liver tissue(×200, 50 μm)

2.5 肝脏中α-SMA、ColI、TGF-β1、Smad7 mRNA水平由Tab 3可知,与正常对照组相比,模型组大鼠α-SMA、ColI、TGF-β1 mRNA含量明显升高,Smad7含量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组相比,DMDD给药组大鼠α-SMA、ColI、TGF-β1 mRNA含量变化明显下调,Smad7含量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。

Tab 3 Effect of DMDD on α-SMA, ColI, TGF-β1, Smad7 mRNA

2.6 肝脏组织中α-SMA,ColI,TGF-β 1、Smad2、Smad7蛋白表达结果由Fig 2可知,肝脏中α-SMA、Smad2的阳性表达主要位于间质细胞,ColI、TGF-β1阳性表达主要位于胞浆中,Smad7的阳性表达位于胞核。与正常对照组相比,模型组α-SMA、ColI、TGF-β1、Smad2阳性表达量明显增多,Smad7阳性表达含量明显减少。与模型组相比,DMDD给药组α-SMA、ColI、TGF-β1、Smad2阳性表达明显减少,Smad7阳性表达含量明显增多。

Fig 2 Effects of DMDD on expression and histologic localization of hepatic fibrosis-related factorsof liver in rats administered with CCl4(×400, 100 μm)

2.7 肝脏组织中TGF-β1,Smad4,Smad7蛋白表达情况由Fig 3可知模型组大鼠肝脏组织中TGF-β1、Smad4蛋白水平较正常组明显升高,Smad7蛋白水平明显下降(P<0.01或P<0.05)。DMDD干预后,以上3项指标发生反向改变,即TGF-β1、Smad4蛋白水平下调,Smad7蛋白水平上调(P<0.01或P<0.05)。

Fig 3 Effects of DMDD administration on protein expression of TGF-β1, Smad4, Smad7 of liver in rats administered with

3 讨论

CCl4具有明显的肝毒性,连续间断反复刺激可引起肝纤维化,具备造模率高的特点[9]。肝脏损伤后,肝细胞破裂,胞内各种酶释放到血液中,以AST、ALT变化最为明显[10]。所以常以AST、ALT水平评价肝脏损伤程度。肝脏组织HE染色和Masson染色为被认为是鉴定肝纤维化和纤维化分级的金指标,通过染色结果可观察到肝纤维化肝脏内细胞排列紊乱,肝小叶及肝窦损坏消失,纤维结缔增生明显[11]。实验结果表明,模型组大鼠血清AST、ALT明显升高,病理染色可见大量纤维结缔组织生成,纤维桥形成,说明造模成功。DMDD给药组大鼠血清中AST、ALT水平明显降低,肝脏病理检测结果显示纤维结缔增生明显减少,肝细胞排列较为整齐,炎症浸润明显减少。

正常肝脏内细胞外基质(extra cellular matrix, ECM)的沉积与降解处于动态平衡。当肝纤维化发生时,ECM的合成增多,降解减少,导致肝脏内ECM的沉积与降解失去平衡,大量ECM沉积于肝脏中,最终形成肝纤维化[12]。ECM的组成包括纤维和基质,基质有LN、HA,纤维主要是胶原纤维。目前已知在肝纤维化发生过程中主要的胶原纤维有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型,其中Ⅰ型最常见,占成纤维细胞合成胶原约80%[13]。在模型组中,可发现LN、HA、ColI、ColⅢ、ColⅣ水平明显升高,说明在肝纤维化形成过程中,上述物质大量存在。DMDD给药干预组大鼠血清及肝脏中LN、HA、ColI、ColⅢ、ColⅣ明显下调,说明对于CCl4诱导的肝纤维化具有逆转的作用。

肝纤维化形成过程中有多种细胞因子参与,其中以TGF-β1最为重要,是目前已知最强的致肝纤维化的细胞因子[14-15]。TGF-β1通过结合肝细胞表面的相应受体,调控Smads蛋白转导通路,诱导细胞凋亡,增加ECM合成,抑制ECM降解等,使肝纤维化加剧[16]。Smads蛋白家族是TGF-β信号通路的关键传导分子,受体调控型Smad(R-Smad)2、3介导TGF-β信号传导,通用型Smad(Co-Smad)4是TGF-β信号传导的必需分子,抑制型Smad(I-Smad)7抑制TGF-β信号传导[17]。因此阻断TGF-β1/Smads信号通路不仅能减少ECM的形成,同时能降低肝纤维化的程度。在模型组中可见TGF-β1、Smad2、4蛋白表达水平明显提高,而Smad7蛋白表达水平明显降低,DMDD给药干预后上述指标明显得到逆转,说明其可能通过干预TGF-β1/Smads信号通路干预肝纤维化的病情进展。

DMDD高、低剂量组抗肝纤维化的作用结果相差不大,提示其抗肝纤维化作用与剂量梯度关系不明显。秋水仙碱能抑制肝纤维化过程中纤维的增生,而肝纤维化的发生受到TGF-β1/Smads信号通路的调控,其可能也通过调控TGF-β1/Smads信号通路参与抗肝纤维化过程。

综上所述,DMDD对CCl4诱导的肝纤维化具有改善作用,可能与其调控TGF-β1/Smads信号通路有关。