SIRT1/Nrf2/HO-1通路在七氟烷后处理改善失血性休克复苏小鼠空间学习与记忆障碍中的作用

牛志伦,张 丽,胡 溯,吴雨洁,万晓静,胡宪文

(安徽医科大学第二附属医院麻醉与围术期医学科,安徽 合肥 230601)

失血性休克严重危害人类生命健康。治疗失血性休克临床常用办法是液体治疗,尽快补充循环血量,但常会诱发脑缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤,出现组织和细胞损害[1]。研究报道,七氟烷能减轻脑I/R损伤[2]。本课题组前期研究证实[3],七氟烷后处理通过增加沉默信息调节因子1(silent information regulation 1,SIRT1)表达,缓解再灌注后小鼠海马神经元线粒体功能损伤,改善认知水平,但其发挥作用的确切机制尚不清楚。脑再灌注损伤涉及多种因素,其中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的过量产生会引起组织多糖、蛋白质和脑脂质的氧化应激损伤,进一步造成细胞死亡和神经系统功能损害[4]。因此,本研究以氧化应激为切入点,探索七氟烷缓解脑I/R损伤的机制和路径。

SIRT1的神经保护作用已在脑I/R中得到证实[3]。近年来,有研究发现SIRT1可以激活核因子E2相关因子2(nuclear transcription factor E2 related factor 2,Nrf2),减少线粒体氧化应激,增加ATP产生,使线粒体膜电位正常化,进而减少I/R时的氧化损伤[5-6]。亦有研究证明,Nrf2可以促进抗氧化因子血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)表达,降低缺氧/复氧时细胞凋亡率和线粒体ROS水平,发挥抗氧化作用[7-8]。基于SIRT1/Nrf2/HO-1信号通路在I/R事件中的积极作用,本研究拟观察七氟烷后处理是否通过SIRT1/Nrf2/HO-1通路,改善失血性休克复苏小鼠氧化应激与空间学习记忆障碍,为临床预防I/R脑损伤提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 8～10周龄的健康C57BL/6J小鼠,♂,由安徽医科大学动物实验中心提供,动物生产许可证号：SYXK(皖) 2020-0005。

1.1.2试剂 七氟烷(货号：83291),购自AbbVie公司;SIRT1抑制剂EX527(货号：CSN10146),购自CSNpharm公司;Nrf2抑制剂ML385(货号：B8300),购自美国APExBIO公司;SIRT1抗体(货号：ab110304)、HO-1抗体(货号：ab189491),均购自Abcam公司;Nrf2抗体(货号：AF0639)、ECL显影液(货号：KF8003),均购自Affinity公司;ATP试剂盒(货号：S0026),购自碧云天生物技术有限公司;ROS、丙二醛(malonaldehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)试剂盒(货号：E004-1、A003-1、A001-3),均购自南京建成生物工程研究所。

1.1.3仪器 七氟烷蒸发罐(Drager公司);RSP01双向全自动输液泵(嘉兴贝塔仪器有限公司);水迷宫实验分析系统(深圳市瑞沃德公司);Tanon-4600SF凝胶成像仪(上海天能科技公司);Varioskan LUX多功能酶标仪(赛默飞世尔科技公司);气体检测仪(深圳迈瑞生物公司)。

1.2 方法

1.2.1动物分组与小鼠失血性休克复苏模型的制备 将小鼠随机分为5组：假手术组(Sham组)、失血性休克与复苏组(HSR组)、七氟烷后处理组(Sevo组)、Sevo+EX527组、Sevo+ML385组,每组16只。小鼠麻醉前禁食12 h,自由饮水。腹腔注射1%戊巴比妥(50 mL·kg-1)麻醉,保持自主呼吸,仰卧位固定。将PE10管置入小鼠右颈总动脉和颈静脉,完成后将300 U·kg-1的肝素输入小鼠静脉观察10 min,然后将连接导管的1 mL注射器装入注射泵,使用注射泵从小鼠动脉持续抽血30 min,总体积是小鼠40%总血容量。失血1 h后,将血液经右颈静脉于30 min内重新注射入小鼠体内,完成失血性休克和复苏术。Sham组仅在动静脉中置入PE10管,不抽血。Sevo组先进行抽血,回输血液时吸入由95% O2、5% CO2带动的七氟烷,七氟烷呼气末浓度为2.4%。Sham组和HSR组在同样节点吸入95% O2、5% CO2混合气30 min。Sevo+EX527组于置入导管前30 min由腹腔注射SIRT1抑制剂EX527(10 mg·kg-1)。Sevo+ML385组于置管前30 min由腹腔注射Nrf2抑制剂ML385(30 mg·kg-1),其余操作同Sevo组。

1.2.2小鼠空间与学习记忆能力测定 各组剩余小鼠于术后4～10 d实施水迷宫测试。小鼠每日进行4次练习,使小鼠朝向水池壁,依次选取Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限送进水池,统计1 min内到达平台的时间为逃避潜伏期。如小鼠没能到达平台,在人为帮助下游向平台并等候10 s,此次测试成绩为60 s。两次训练相隔20 min,当天潜伏期为4次测试的平均值,共训练6 d。d 7将平台移除,让小鼠自行游动60 s,记录小鼠目标象限路程及穿越平台的次数,测试在每日13 ∶00-17 ∶00之间进行。

1.2.3海马组织ATP含量测定 I/R术后24 h,各组取6只小鼠的右侧海马组织用于ATP、ROS、MDA和SOD检测,置于-80 ℃冰箱冻存。组织加入裂解液匀浆后,离心取上清。依照ATP检测说明书操作。将标准品按照需要配制成一定的浓度梯度,每孔加100 μL稀释后的ATP检测工作液,然后向检测孔中添加20 μL待测样品或标准品,放入酶标仪,使用化学发光检测每孔相对光单位(relative light unit,RLU)值。绘制标准曲线得出组织中ATP水平,除以上清液中蛋白浓度得出相对ATP含量。

1.2.4海马组织ROS含量测定 取海马组织剪碎,用PBS冲洗1遍。加入一定量酶消化液,消化20 min,而后使用尼龙网滤过组织,离心收集沉淀。将DCFH-DA与沉淀混匀,置于水浴锅中孵育30 min。收集孵育后的悬液,离心收集沉淀,洗去残余的DCFH-DA。离心,收集沉淀,用PBS重悬,使用多功能酶标仪测定其荧光信号。

1.2.5MDA和SOD含量测定 称取海马组织,加入一定量生理盐水制备匀浆,离心取上清,检测上清液蛋白浓度。依据试剂盒操作步骤,检测海马组织MDA和SOD水平。

1.2.6Western blot法检测蛋白的表达 水迷宫实验完成后,取海马组织加入裂解液,加入磁珠研磨,冰上放置充分裂解,离心取上清,测蛋白浓度。取20 μg组织蛋白进行PAGE凝胶电泳,200 mA电流转移至膜上,快速封闭液封闭20 min,将膜加入对应一抗中孵育过夜,再加入二抗继续孵育1 h。滴加显影液,采用凝胶成像仪化学发光显影,蛋白条带相对灰度值利用ImageJ软件测定。

2 结果

2.1 七氟烷对小鼠潜伏期的影响如Fig 1所示,与HSR组相比,水迷宫实验第4、5、6天,Sham组和Sevo组小鼠潜伏时间明显缩短(P<0.01);与Sevo组比较,Sevo+EX527组和Sevo+ML385组小鼠潜伏时间延长(P<0.01)。提示EX527和ML385逆转了七氟烷后处理对小鼠认知功能的保护作用。

Fig 1 Effect of sevoflurane on latency n=10)

2.2 七氟烷对小鼠目标象限路程与穿越平台次数影响如Fig 2所示,与HSR组比较,Sham组和Sevo组小鼠平台象限运动距离及穿越平台次数明显增加(P<0.05,P<0.01);与Sevo组比较,Sevo+EX527组和Sevo+ML385组小鼠平台象限运动距离及穿越平台次数明显降低(P<0.01)。上述结果表明,七氟烷后处理对小鼠认知功能的保护与SIRT1和Nrf2相关。

Fig 2 Effect of sevoflurane on target quadrant distance and crossing platform n=10)

2.3 七氟烷对海马ATP和ROS含量影响Fig 3结果显示,与HSR组比较,Sham组和Sevo组小鼠海马ATP含量明显增加,ROS含量明显减少(P<0.01);与Sevo组比较,Sevo+EX527组和Sevo+ML385组小鼠海马ATP含量明显降低,ROS含量明显升高(P<0.01)。提示EX527和ML385逆转了七氟烷后处理ATP和ROS水平。

Fig 3 Effect of sevoflurane on ATP (A) and ROS (B) contents in n=6)

2.4 七氟烷对海马SOD和MDA水平影响如Fig 4所示,与HSR组相比,Sham组和Sevo组SOD活性增加,MDA含量降低(P<0.05,P<0.01);与Sevo组相比,Sevo+EX527组和Sevo+ML385组SOD活性降低,MDA含量升高(P<0.05)。提示SIRT1、Nrf2介导七氟烷后处理对小鼠的抗氧化作用。

Fig 4 Effects of sevoflurane on SOD activity (A) and MDA content (B) in n=6)

2.5 SIRT1、Nrf2和HO-1蛋白表达情况如Fig 5所示,与HSR组比较,Sham组和七氟烷组小鼠海马SIRT1、Nrf2和HO-1表达上调(P<0.01);与七氟烷组比较,Sevo+EX527组和Sevo+ML385组小鼠海马上述蛋白表达下调(P<0.05,P<0.01);Sevo+ML385组与七氟烷组比,SIRT1蛋白含量差异无显著性。表明七氟烷后处理通过SIRT1/Nrf2/HO-1通路,发挥对I/R小鼠的保护作用。

Fig 5 Results of protein expression in five n=3)

3 讨论

研究表明,失血性休克再灌注后表现为炎症因子大量释放、细胞凋亡、血脑屏障破坏等,会加剧缺血后脑组织和神经元的损伤[9]。Shi等[10]发现,七氟烷后处理可以减轻失血性休克复苏后大鼠的脑梗死面积、神经细胞凋亡和认知功能障碍。本课题组前期研究也发现,七氟烷后处理可以改善脑I/R小鼠学习记忆能力[3]。研究证实,脑I/R损伤与氧化应激密切相关。在发生组织再灌注损伤的过程中,释放的大量ROS会使呼吸链复合物的功能失活,而呼吸链的损伤进一步增加ROS的产生和积累,触发一系列的细胞氧化损伤[11]。SOD是一种内源性抗氧化酶,能够抑制机体的氧化应激反应。MDA是生物体氧化应激的代谢产物,能够反映脂质过氧化的水平。因而,SOD的活性以及MDA的含量可以提示氧化损伤的水平。有研究表明,七氟烷后处理通过激活Akt/mTOR信号,改善线粒体损伤,增加SOD活性,降低MDA含量,降低线粒体ROS的产生,促进ATP的合成,减轻氧化应激来保护大鼠心脏免受I/R损伤[12]。本研究发现,七氟烷后处理使I/R小鼠海马ROS、MDA含量减少,ATP含量和SOD活性升高,说明七氟烷后处理具有减轻失血性休克后海马神经元氧化应激的作用。

SIRT1可以在多种信号转导途径中对蛋白质底物进行去乙酰化,调控基因表达、控制细胞周期进程,具有保护神经、调节细胞代谢和氧化应激的作用[13]。本课题组前期实验利用小鼠失血性休克与复苏模型,证实了七氟烷后处理通过增加SIRT1表达,减少失血性休克再灌注小鼠海马神经元的凋亡[3]。SIRT1蛋白的升高可以缓解神经元的变性,降低促炎因子水平和线粒体损伤,减轻脑I/R损伤[14]。Song等[15]利用短暂性大脑中动脉闭塞实验证实,促进SIRT1表达可以改善I/R后小鼠神经元损伤和细胞凋亡,抑制氧化应激。本实验通过对七氟烷后处理小鼠注射SIRT1抑制剂EX527来减弱SIRT1的表达,小鼠行为学测试的潜伏期明显延长,目标象限路程及穿越平台次数明显减少;海马组织ROS、MDA含量升高,ATP水平和SOD活性降低,表明SIRT1参与七氟烷后处理改善脑I/R小鼠氧化应激和空间学习与记忆能力。

近年来,有研究指出SIRT1被激活后,可以通过促进Nrf2的表达改善氧化水平[16]。Nrf2是细胞对抗氧化损伤和保持氧化还原稳态的关键分子之一,Wang等[7]的研究表明,Nrf2可以通过促进HO-1的表达,抑制氧化应激引起的I/R损伤。本实验中,HSR组小鼠海马组织SIRT1、Nrf2、HO-1蛋白表达减少,七氟烷后处理上调了SIRT1、Nrf2的表达,并促进了其下游抗氧化蛋白HO-1的表达。相反,通过注射SIRT1抑制剂EX527降低了七氟烷后处理对蛋白表达的上调作用。

研究表明,HO-1能够维持I/R大鼠血脑屏障的完整性,缓解脑I/R后的继发性脑损伤和认知功能障碍[17]。HO-1可以提高线粒体膜电位,降低线粒体氧化产物,来抵御缺氧/复氧对细胞产生的氧化损害[8]。HO-1的缺失可以加重氧化应激损伤,而HO-1基因被激活后,可以改善氧化应激引起的复合物的功能障碍,增加线粒体内ATP的水平[18]。本研究在七氟烷后处理的基础上,进一步使用ML385抑制小鼠中Nrf2的表达,发现小鼠海马组织中Nrf2、HO-1蛋白表达有明显减少,而SIRT1的表达与Sevo组比没有明显变化;ATP含量及SOD活性降低,MDA、ROS含量升高。同时,小鼠逃避潜伏期明显增加,平台象限运动距离及越过平台次数减少。这些结果证明,七氟烷后处理可能通过激活SIRT1/Nrf2/HO-1信号通路,减少氧化应激,进而减轻脑I/R损伤。

综上所述,七氟烷后处理可以通过增加SIRT1、Nrf2的表达,进一步活化HO-1,减轻氧化应激,从而减少脑I/R损伤,改善小鼠的空间学习与记忆能力。