眼镜蛇毒细胞毒素-1的分离纯化及其对HSC-LX2细胞PI3K/AKT 信号通路的影响

孔露平,王秀男,廖 明,张学荣,周 怡,张 昊,罗小玲,3

(1. 广西医科大学基础医学院,2. 广西医科大学生命科学研究院,3. 广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部,广西 南宁 530021)

肝纤维化是多种刺激诱导的肝脏反复损伤的一种病理再生反应[1],其主要表征是肝脏中沉积着过量的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)。ECM产生主要原因之一是由于肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)被大量激活分化,磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路是一条重要的细胞内信号通路,能通过影响HSC的增殖和凋亡来调节肝纤维化[2-4]。

细胞毒素(cadiotoxins,CTXs) 是蛇毒主要活性成分之一[5],对多种癌细胞具有选择性抑制性[6-8]。已有学者在抗肝纤维化研究中利用CTX来诱导HSC凋亡[9]。本课题组前期已证明CTX-1对LX2细胞具有选择性杀伤作用[10],本研究旨在探索CTX-1如何通过PI3K/AKT信号通路调控HSC增殖与凋亡的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1人肝星状细胞(HSC-LX2) 保存于广西医科大学基础医学院。

1.1.2主要试剂与仪器 眼镜蛇毒粗毒冻干粉,由广西医科大学生命科学研究院提供;DEAE-琼脂糖凝胶 CL-6B 填料、葡聚糖凝胶 G-50 填料(上海博格隆生物技术有限公司,批号分别为2018051302、2016021902); Macro-prep High S 预装柱(美国 BIO-RAD 公司,货号为7324130);细胞周期检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,货号为C1052);AKT单克隆抗体、p-AKT 单克隆抗体(北京博奥森生物科技有限公司,货号分别为bsm-33325M、bsm-33281M);PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002(美国Target mol公司,货号为T15799);Beckman Coulter流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司);透射电子显微镜(日本日立公司);多功能酶标仪(美国安捷伦科技有限公司); Odyssey红外荧光扫描成像系统(美国 LI-COR 公司);KTATM start 色谱系统(美国 GE 公司)。

1.2 方法

1.2.1眼镜蛇毒CTX-1的分离纯化 称取2 g眼镜蛇毒粗毒冻干粉,经溶解、离心、过滤后上样于层析柱,经DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B弱阴离子交换层析、葡聚糖凝胶G-50分子筛层析及 Macro-prep High S 强阳离子交换层析进行分离、洗脱和纯化。纯度经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定,蛋白质相关组分和分子量经质谱(NanoLC-ESI-MS/MS)进行分析。

1.2.2流式细胞术检测细胞周期 将HSC-LX2细胞分为控制组和实验组两组,实验组给予1、2、4 mg·L-1的CTX-1,采用流式细胞术观察各组细胞的周期分布特点。

1.2.3透射电镜观察细胞形态 将HSC-LX2细胞分为控制组和实验组,实验组CTX-1作用浓度为2 mg·L-1,样品经切片、染色等步骤后于透射电子显微镜下,观察细胞的形态变化。

1.2.4蛋白质免疫印迹法测定不同干预时间后HSC-LX2细胞中AKT蛋白磷酸化水平的变化 用2 mg·L-1的CTX-1处理HSC-LX2,通过蛋白质免疫印迹法测定不同处理时间(0、3、6、9、12 h)后AKT蛋白磷酸化水平的变化。

1.2.5蛋白质免疫印迹法检测HSC-LX2细胞暴露于不同干预剂后其AKT蛋白磷酸化水平的变化 将CTX-1与抑制剂LY294002(按照控制组、2 mg·L-1CTX-1组、50 μmol·L-1抑制剂LY294002组、2 mg·L-1CTX-1+50 μmol·L-1抑制剂LY294002组分组)作用于HSC-LX2 ,采用蛋白质免疫印迹法检测AKT蛋白磷酸化水平。

2 结果

2.1 CTX-1的分离纯化三步层析后,获得电泳纯的CTX-1 ,质谱鉴定结果显示其分子量为9.499 ku。

2.2 CTX-1主要阻滞HSC-LX2细胞周期的DNA合成期流式细胞术结果显示, CTX-1干预HSC-LX2细胞24 h后,DNA合成期所占比例与控制组23.90%±1.60%相比分别递增至30.24%±2.72%、33.12%±2.93%(P<0. 05)和40.43%±1.35%(P<0.01),同时DNA合成前期及后期显示其百分比降低,说明CTX-1主要阻滞HSC-LX2细胞周期的DNA合成期。

2.3 CTX-1促进HSC-LX2细胞的凋亡透射电镜结果显示经CTX-1干预后的HSC-LX2细胞染色质固缩、边集,有明显凋亡特征,形成凋亡小体,而控制组细胞形态均正常,无明显凋亡征象,说明CTX-1对HSC-LX2细胞有促凋亡作用。

2.4 CTX-1抑制p-AKT蛋白的表达蛋白质免疫印迹法结果显示,与控制组相比,经CTX-1处理不同时间后的LX2细胞中的AKT蛋白相对表达水平无明显差异(P>0.05),相反,暴露6 h后,各组p-AKT的相对表达量明显降低,且随暴露时间(6～12 h)的推移呈下降趋势(P<0.05),这提示CTX-1可抑制p-AKT 蛋白的表达,继而抑制 PI3K/AKT 信号通路的激活。

2.5 CTX-1 联合 LY294002 对 p-AKT 表达的抑制作用最为明显研究结果表明,不同抑制剂作用HSC-LX2后对AKT蛋白的相对表达量影响幅度不存在显著性差异(P>0.05),而实验组p-AKT蛋白的相对表达量与控制组相比则显示明显降低(P<0. 01),其表达水平从低到高为CTX-1+抑制剂LY294002组、抑制剂LY294002组、CTX-1组、控制组,提示CTX-1与抑制剂LY294002联合使用时具有增强作用,对p-AKT蛋白表达的抑制作用最为显著。

3 讨论

本研究将高纯度的CTX-1作用于HSC-LX2细胞,揭示了CTX-1通过阻断细胞周期的DNA合成期及通过抑制PI3K/AKT信号通路中p-AKT蛋白的表达来调控HSC-LX2增殖与凋亡的机制。本研究首次分析了CTX-1对HSC-LX2细胞PI3K/AKT信号通路的影响,为CTX-1在肝纤维化防治中的应用研究提供了理论依据。