去卵巢骨质疏松大鼠腹腔注射白藜芦醇及雌二醇的效果评价

黄燕 李钰娜 宋丽华 牛晓红 冀菁荃 李卿

1.长治医学院基础医学部生化教研室,山西 长治 046000

2.运城护理职业学院,山西 运城 044000

3.长治医学院附属和济医院内分泌科,山西 长治 046000

4.长治医学院基础医学部病生教研室,山西 长治 046000

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是由于自然绝经或卵巢切除导致体内雌激素水平下降,钙吸收不良,骨质流失[1-2]等全身代谢性骨病,超过30%的女性绝经后患有由骨质疏松引起的全身性骨痛和骨微结构改变。目前治疗PMOP的方法很多,经典的治疗方法是雌激素替代疗法(estrogen replacement therapy,ERT)。雌激素通过刺激成骨细胞分泌胰岛素样生长因子、骨保护素、转化生长因子,抑制破骨细胞成熟,刺激成骨细胞分化[3],其疗效肯定,但长期应用有增加冠心病、子宫内膜癌、乳腺癌等发生的风险,尤其是对雌激素敏感的乳腺癌患者及乳腺癌高风险人群[4]。因此,寻找更为理想的化合物辅助治疗PMOP成为目前研究的热点。

白藜芦醇(resveratrol,RSV)是一种相对分子质量为228的天然植物雌激素,存在于多种水果、蔬菜和中药中。RSV可调节骨细胞代谢和骨转换[5],能有效降低机体老化和绝经后雌激素缺乏引起的骨质疏松[6]。RSV通过多种机制促进成骨细胞增殖分化和抑制破骨细胞生成,如通过Wnt/β-catenin信号通路促进犬骨髓间充质干细胞的成骨分化[7];通过活化SIRT-1/FoxO1通路促进间充质干细胞向成骨细胞方向分化[8];通过促进自噬诱导小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的增殖和分化[9],0.1～10 μmol/L浓度范围的RSV通过抑制自噬来抑制破骨细胞的分化[10];RSV以40 mg/(kg·d)、80 mg/(kg·d)灌胃10周可通过提高骨密度和改善骨微结构来防止卵巢切除术引起的骨质量恶化[11]。尽管RSV对骨质疏松症影响的数据不断积累,但对于腹腔注射白藜芦醇相较于雌二醇的效果和安全性实验较少。本研究在选择给药方式时,综合生物利用度、给药难度、药物剂型等因素,最终选择腹腔注射。通过制作绝经后骨质疏松模型,对比RSV及雌二醇对PMOP的影响,以期为RSV作为潜在治疗PMOP的辅助性用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物:8周龄雌性SD大鼠购自北京华阜康生物科技有限公司(许可证号:SCXK2019-0008)。大鼠在SPF级动物实验室饲养,相对湿度60%,温度25 ℃,光/暗循环12 h。采用统一标准饲料喂养,各组饲养条件相同。本研究经长治医学院动物伦理审查委员会批准同意。

1.1.2实验试剂与仪器:白藜芦醇(RSV,C14H12O3,R8350)购自Solarbio(中国北京)。二甲基亚砜(DMSO,Solarbio,北京,中国)溶解白藜芦醇。β-雌二醇(CAS:50-28-2)购自sigma公司。肌酐测定试剂盒(C011-2-1)及尿素氮测试盒(C013-2-1)购自南京建成生物工程研究所。全身双能X射线吸收仪(DXA,Hologic ASY-00409)购自美国Hologic公司。

1.2 实验方法

1.2.1构建大鼠PMOP模型及样本收集:适应性喂养2周后,将50只大鼠随机分为5组(每组10只):正常(CONTROL)组、假手术(Sham)组、去卵巢(OVX)组、OVX+白藜芦醇(OVX+RSV)组、OVX+雌激素(OVX+E)组。OVX组大鼠手术切除双侧卵巢,Sham组切除卵巢周围相同大小的脂肪,见图1。术后1周,OVX+RSV组腹腔注射RSV[10 mg/(kg·d)],OVX+E组腹腔注射β-雌二醇[0.1 mg/(kg·d)]。Sham组和OVX组注射生理盐水。每周称量体重,干预12周后,收集所有动物血清、双侧股骨、心脏、肝脏、胰腺和肾脏。

图1 背侧双切口切除雌性SD大鼠双侧卵巢Fig.1 Bilateral ovariectomy of female SD rats through dorsal double incisions

1.2.2苏木精-伊红(HE)染色:右侧股骨用4%多聚甲醛固定,切片前用EDTA脱钙液脱钙21 d。将脱水的样品包埋于石蜡中,切片4 μm厚,HE染色,倒置显微镜下观察,采集图像。

1.2.3Goldner染色:解剖后,左侧股骨在4%多聚甲醛中固定24 h后,通过梯度浓度的乙醇(70%～100%)和二甲苯脱水,嵌入甲基丙烯酸甲酯(MMA),对5 μm厚的切片进行Goldner染色。

1.2.4双能X射线吸收分析:各组SD大鼠于测量前12 h禁食禁水,腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后,放置于全身双能X射线吸收仪扫描,采用高分辨率模式,检测骨密度(BMD,g/cm2)、体脂率(BFP,%)和肌肉量(Lean mass,%),每4周检测1次。最终由设备制造商提供小动物身体组成软件(Hologic QDR软件的Windows XP,版本12.3)完成数据分析。

1.2.5脏器系数:实验12周后,所有动物禁食24 h,记录安静状态下大鼠体质量;腹腔注射戊巴比妥钠(30 mg/kg),取心脏、肝脏、胰腺和肾脏,并称重。脏器系数表示为[器官质量(g)/体质量(g)]×100%。

1.2.6血清肌酐及血清尿素氮水平的测定:大鼠取仰卧位,30 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后于腹主动脉取血至负压采血管中,室温静置1 h,8 000 r/min离心,共10 min,取上层血清,使用试剂盒检测各组大鼠血清肌酐及尿素氮水平。

1.3 统计学处理

数据以均数±标准误(SEM)表示。使用SPSS 26.0软件通过单因素方差分析(ANOVA)评估各组间的统计差异。方差相等时采用最小差异检验(least significant difference,LSD),方差不相等时采用Tamhane ’s T2检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白藜芦醇对大鼠体重的影响

在12周内,每组大鼠体重均在一定范围内波动,总体呈上升趋势(图2),统计学分析结果显示各组间均无显著性差异(P>0.05)。

图2 不同组别大鼠每周体重变化Fig.2 Weekly weight changes of rats in different groups

2.2 白藜芦醇对骨组织形态学的影响

HE染色结果显示,CONTROL组及Sham组骨小梁密集,具有排列规则的致密网络。OVX组骨小梁变薄,小梁间隙增加,网络结构破坏。OVX+E组处理12周后骨小梁结构有明显改善。在大鼠RSV干预12周后,与OVX组相比,骨小梁网络连接得到改善,且骨小梁结构更厚和更规则。Goldner染色结果显示,与Sham组相比,OVX组股骨远端矿化小梁(绿色区域)的数量和厚度均显著降低。OVX组大鼠骨小梁数目和容积减小、髓腔加宽、出现骨小梁网络结构破坏区,说明绝经后骨质疏松大鼠建模成功。与OVX组相比,OVX+RSV组与OVX+E组骨小梁数量和小梁厚度显著增加,骨小梁分离度显著降低,见图3。

图3 各处理组股骨HE染色及Goldner染色(50×)Fig.3 Femoral HE staining and Goldner staining were performed in each treatment group (50×)

2.3 白藜芦醇对DXA测量结果的影响

2.3.1各组对大鼠BMD的影响:4周与8周时,各组间无显著性差异(P>0.05),12周时,与Sham组相比,OVX组BMD显著降低(P<0.05),与OVX组相比,OVX+RSV组与OVX+E组BMD升高,但差异不显著(P>0.05),OVX+RSV组与OVX+E组之间无显著性差异(P>0.05)。

2.3.2各组对大鼠BFP的影响:4周与8周时,各组间BFP无显著性差异(P>0.05),12周时,与Sham组及OVX组相比,OVX+RSV组BFP降低不显著(P>0.05),OVX+E组BFP显著性降低(P<0.05),OVX+RSV组与OVX+E组之间无显著性差异(P>0.05)。

2.3.3各组对大鼠肌肉含量的影响:4周与8周时,各组间肌肉含量无显著性差异(P>0.05),12周时,与Sham组及OVX组相比,OVX+RSV组肌肉含量无显著变化(P>0.05),OVX+E组肌肉含量明显升高(P<0.05),OVX+RSV组与OVX+E组之间无显著性差异(P>0.05),见图4。

图4 各组大鼠DXA测量结果分析Fig.4 Analysis of DXA measurement results of rats in each group

2.4 白藜芦醇对大鼠脏器系数的影响

通过各组间脏器系数比较显示(图5),肝脏、胰腺及心脏系数各组之间无显著性差异(P>0.05);与CONTROL组和OVX组相比,OVX+RSV组的肾脏系数显著降低(P<0.05),OVX+RSV组与OVX+E组各脏器系数之间无显著性差异(P>0.05)。

图5 各组大鼠各脏器系数结果统计Fig.5 Statistics of coefficients of various organs of rats in each group

2.5 白藜芦醇对血清肌酐及血清尿素氮水平的影响

与CONTROL组及OVX组相比,OVX+RSV组大鼠空腹血清尿素氮和肌酐水平均显著降低(P<0.05),OVX+E组肌酐水平显著降低(P<0.05),见表1。

表1 RSV对大鼠血清尿素氮及血清肌酐水平的影响

3 讨论

PMOP主要是由于体内雌激素水平下降引起全身骨量减少的代谢性疾病[12]。20世纪70年代已有临床研究证实ERT可以缓解绝经后的骨质疏松。然而,长期服用雌激素存在诱发肿瘤、心血管疾病等风险[4]。植物雌激素是一类在结构或功能上模仿哺乳动物雌激素的植物源非甾体化合物,可以抑制骨吸收,促进骨形成,同时可以克服ERT的副作用[13]。有文献表明植物雌激素可以通过ER或非ER通路影响骨代谢,如淫羊藿苷通过激活雌激素受体介导的BMP/Smad信号转导通路促进前成骨细胞MC3T3-E1的分化[14-15],补骨脂素可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路显著提高PMOP模型大鼠的骨密度、骨钙素等指标,改善绝经后大鼠的骨质疏松[16]。RSV作为一种天然雌激素,已有文献表明其作用机制为:通过抑制ROS/HIF-1α信号通路,促进成骨细胞的生成[17];激活雌激素介导的细胞外信号调节激酶(ERK)1/2和JNK信号通路调控成骨细胞的分化和增殖[18];通过SIRT1和Wnt/-catenin信号通路降低PPARγ水平促进成骨分化[19]。本课题组前期研究表明RSV在体外通过CaN/NFATc1通路促进前成骨细胞MC3T3-E1的分化和成熟[20],但RSV在临床应用中的安全性和有效性仍有待验证。因此,本实验通过建立绝经后骨质疏松动物模型,探讨RSV抗PMOP的效果与安全性。

白藜芦醇对大鼠体重影响的结果显示,体重的增长各组间无显著性差异,说明腹腔注射10 mg/(kg·d) RSV对体重影响不明显。BMD检测结果表明,12周时,与Sham组相比,OVX组BMD显著降低,说明切除卵巢可显著降低BMD导致骨质疏松的发生。与OVX组相比,OVX+RSV组与OVX+E组BMD保持与CONTROL组相近的BMD,说明白藜芦醇与雌二醇有相似的缓解BMD降低的作用。BFP检测结果表明,12周时,OVX+E组BFP显著降低。由于雌激素能够调控成骨和成脂分化,当雌激素缺乏时,机体会出现成骨分化和脂肪代谢障碍,从而引发骨质疏松症和中心性肥胖[21],脂肪在体内过度堆积导致体脂率增高,所以雌二醇的补充可有效降低BFP。而白藜芦醇降BFP的效应则较缓和,与CONTROL组和Sham组相比,BFP有所下降,但作用不显著。通过对大鼠肌肉含量的测定可以看出,12周时,OVX+E组肌肉含量显著升高,可能由于雌激素作用于成肌细胞表面受体,促进成肌细胞的增殖分化[22]。此外,Kohara[23]的研究表明,脂质库增加能降低氨基酸的利用率和肌纤维蛋白的合成量,因此,体内脂肪过多可能会诱发和加剧肌肉减少。由此可知,随着体脂率的上升,肌肉含量相应减少。对于OVX+RSV组来说,作用较为温和,与CONTROL组和Sham组相比差异不显著。

脏器系数结果表明,除白藜芦醇显著降低肾脏系数外,肝脏、胰腺及心脏系数各组间差异不显著。脏器系数降低常提示脏器萎缩或功能受损[24],说明白藜芦醇可能会造成肾脏功能损伤。因此,为了进一步确定肾功能状态,行大鼠空腹血清尿素氮和肌酐水平测定,血尿素氮主要由蛋白质分解代谢而来,经肾小球滤过随尿排出,血中尿素氮水平升高往往见于器质性肾功能损伤。血清中肌酐主要通过骨骼肌中磷酸肌酸的非酶促反应生成,经肾小球滤过随尿排出体外,当肾功能障碍时,肌酐排出受阻,血中浓度升高。因此,临床上常用血尿素氮和肌酐水平作为评估肾功能的指标[25]。本研究结果显示,与CONTROL组及OVX组相比,OVX+RSV组大鼠空腹血清尿素氮和肌酐水平均显著降低,OVX+E组肌酐水平显著降低,因此,并未发现白藜芦醇造成肾功能障碍。当然,也有实验数据表明,SD 大鼠白藜芦醇[3 000 mg/(kg·d)]灌胃28 d出现血清尿素和肌酐水平升高,肾脏组织病理学改变的发生率和损伤程度加重,表现出肾毒性[26]。本实验选择腹腔注射白藜芦醇10 mg/(kg·d)并未出现肾功能障碍,可能与给药剂量、给药方式及给药时间有关。总之,脏器系数只是从整体上反映白藜芦醇对主要器官是否有损伤,而对各脏器的形态学改变并不能判别,后续课题组将进一步通过整体和微观两方面进行实验研究。

骨组织HE染色和Goldner染色结果显示,OVX组出现骨质疏松征象,如骨小梁排列稀疏,骨小梁变薄断裂。与OVX组相比,OVX+RSV组与OVX+E组骨小梁数量和小梁厚度显著增加,骨小梁网络连接得到改善,骨小梁分离度降低。说明白藜芦醇能够有效改善雌激素降低引起的骨质疏松,且其效果与雌二醇相当。亦有动物实验表明,白藜芦醇8.4 mg/(kg·d)灌胃8周可增加骨密度、提高骨强度、促进骨形成[27]。

综上所述,腹腔注射白藜芦醇具有与雌激素相当的提高大鼠股骨BMD的作用,且未发现有明显毒副作用,具有较高安全性,为白藜芦醇在抗骨质疏松方面的应用提供了理论基础。