木薯MeEIN3.1基因克隆及其在采后生理性变质中的信号转导

赖锦涛, 杨静琳, 罗佳科, 陈志晟, 叶晓雪, 颜 彦, 曾 坚, 胡 伟

(1.韶关学院广东省粤北食药资源利用与保护重点实验室,广东 韶关 512005;2.韶关学院生物与农业学院,广东 韶关 512005;3.中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南 海口 571101)

木薯(ManihotesculentaCrantz)是世界三大薯类作物之一,也是热区重要的粮食作物和经济作物,全球约有7亿人口以木薯为主粮[1-2]。木薯在中国的广西、广东和海南地区是一种重要的经济作物[3],也是具有重大发展潜力的绿色能源作物,其淀粉可用于生产燃料乙醇和工业淀粉[3-4]。然而,木薯块根采收后不能长时间存储,容易出现“采后生理性变质”(post-harvest physiological deterioration, PPD)的现象,这严重阻碍了木薯块根的大规模生产加工[5-6]。乙烯作为植物中的重要激素,在植物的生长发育和胁迫响应中起着重要作用[7-10]。例如,当植物缺水时,乙烯的含量会迅速增加,导致叶片衰老加速并脱落,以平衡植株的含水量[11]。另外,使用乙烯前体处理拟南芥幼苗可以提高植株对盐胁迫的耐受能力[12]。乙烯信号和活性氧含量的变化也有关系[13-14]。例如,在梨中,乙烯通过提高超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性可以抑制采后腐烂[15]。乙烯还可以通过提高拟南芥气孔保卫细胞中的NADPH氧化酶来介导活性氧的产生,从而促使气孔关闭[13]。在拟南芥中鉴定得到的乙烯信号转导通路,主要由乙烯受体(ethylene receptors)、CTR1蛋白激酶(raf-like CTR1)、EIN2(ethylene insensitive 2)、EIN3(ethylene insensitive 3)/EIL1(ethylene insensitive-like1)、ERF1(ethylene response factor 1)以及EBF1/2(EIN3 binding F-box 1 and 2)等关键组分组成[16-18]。Rothenberg et al[19]在拟南芥中首次获得了ein3突变体,随后克隆了EIN3基因及其同源基因EIL1(EIN3-like1)和EIL2。EIN3/EIL1是乙烯信号途径中起正调控作用的信号因子。当EIN3/EIL1在信号通路中积累时,以同源二聚体的形式与ERF1转录因子结合,从而开始初级乙烯响应。激活的ERF1转录因子可以进一步放大传递信号并与相关的非生物胁迫响应基因结合,调控次级乙烯响应基因的表达[20-22]。ERF1是乙烯信号转导通路中重要的下游转录因子,调控下游目标基因的信号传递[8-10]。在拟南芥中,AtEIN3在乙烯应答中起调控作用[18]。乙烯信号通过EIN3/EIL1调控不同基因,例如EIN3调控幼苗的乙烯反应,而EIL1抑制植株茎的伸长和叶片的生长[19,23]。因此,EIN转录因子是乙烯信号转导途径中的重要组成部分。研究结果表明,木薯PPD的发生与活性氧的大量积累有关[24]。本实验室的前期研究发现,通过乙烯处理可以明显抑制木薯块根的PPD过程,并且发现木薯块根中的抗氧化酶活性显著提高,推测通过提高木薯块根中的抗氧化酶活性可以抑制PPD过程。然而,至今尚无关于木薯乙烯信号通路中相关基因的克隆及其在木薯PPD过程中作用的报道。因此,本研究通过挖掘前期木薯PPD过程的转录组数据,利用RT-PCR技术克隆了MeEIN3.1基因,并对其编码的蛋白质序列进行了生物信息学分析,同时对MeEIN3.1在PPD过程中的表达模式进行了分析,为进一步研究MeEIN3.1基因在PPD过程中的功能和信号转导提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

木薯品种为华南8号(中国热带农业科学院种植并提供)。DNA回收纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、pMD18-T载体、荧光定量PCR反应试剂、Nimble Cloning克隆试剂盒、反转录试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司;大肠杆菌DH5α感受态细胞和农杆菌GV3101感受态细胞购自诺唯赞生物科技有限公司;2×TaqMaster Mix酶和T4连接酶购自海南壹田生物科技有限公司,亚细胞定位载体pNC-Green-SubC为本实验室保存,限制性核酸内切酶购自Thermo Fisher Scientific公司。主要仪器设备:超微量紫外分光光度计(Thermo,美国),PCR仪(耶拿,德国),EPS300电泳仪(Tanon,上海),CT15RT高速冷冻离心机(Techcomp,中国),4100凝胶成像仪(Tanon,上海),FluoView FV1000激光共聚焦显微镜(奥林巴斯,日本),MX3000荧光定量PCR仪(安捷伦,美国)。

1.2 材料处理

采摘大田种植10个月的成熟木薯,选取外表皮没有破损的木薯块根,将其切下3～4片(直径约4 cm,厚度4～5 mm),并放在托盘中。设置温度为26 ℃,相对湿度为75%,昼夜长短分别为16 h/8 h的恒温培养箱中,不同处理时间点(0、6、12、48 h)收集块根样品(重复3次),块根样品液氮处理后置于-80 ℃。

1.3 基因克隆和亚细胞定位

根据MeEIN3.1基因的核苷酸序列设计引物,并进行基因扩增(表1)。扩增得到目标基因片段后,将其连接至pMD18-T载体上,并进行测序。将测序正确的菌液和阳性克隆质粒保存。随后,使用Nimble Cloning方法将目标基因连接到pNC-Green-SubC载体上,将获得的表达载体命名为pNC-Green-SubC-MeEIN3.1。经过测序确认无误后,将pNC-Green-SubC-MeEIN3.1和空载对照分别转化至农杆菌GV3101感受态细胞中。转化后,将其侵染烟草叶片并在25 ℃下培养72 h。制片后,使用Fluo View FV1000激光共聚焦显微镜观察荧光信号在烟草叶片细胞中的分布情况。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

1.4 生物信息学分析

利用在线网站ExPASy ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析MeEIN3.1基因编码蛋白的理化性质。利用在线工具SOPMA和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)进行结构预测。在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)中进行保守结构域分析。采用BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和Phytzome数据库(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)搜索及比对分析同源序列,以MEGA-X中的MUSCLE方法进行序列比对,使用Neighbor-joining法构建系统发育树,Bootstrap值设置为1 000。利用Wolf Psort网站(https://wolfpsort.hgc.jp/)进行亚细胞定位预测。

1.5 基因表达分析

根据MeEIN3.1序列设计荧光定量引物(表1),以MeTUB基因作为内参基因,采用实时荧光定量PCR分析MeEIN3.1基因在木薯PPD过程中的表达情况(3次生物学重复)。使用2-ΔΔCt法计算MeEIN3.1基因的相对表达量。

1.6 酵母双杂交

根据相关基因按照上下游互作关系分别构建到pGADT7和pGBKT7载体中,并提取阳性重组克隆菌液的质粒。以pGADT7-T和pGBKT7-53作为阳性对照,pGADT7-T和pGBKT7-Lam作为阴性对照,将阳性对照质粒组合、阴性对照质粒组合以及构建的重组质粒组合两两转化到AH109酵母感受态中进行培养,观察基因编码蛋白的互作情况(表1)。从互作组合的SD/-Leu/-Trp-/His/X-α-Gal培养基上挑取蓝色菌落,将其转移到经过灭菌的200 μL PCR管中,加入100 μL无菌ddH2O并充分混合后吸取2 μL重新接种到SD/-Leu/-Trp-His中,28 ℃培养96 h。再次观察结果,并对再次变蓝的互作组合进行图像保存。

2 结果与分析

2.1 MeEIN3.1基因

在Phytzome数据库中,将拟南芥AtEIN3基因(AT3G20770)的核苷酸序列和木薯基因组进行blast比对,得到6个属于EIN3/EIL1家族的木薯序列。根据实验室前期对木薯块根在采后0、12、24、48 h的转录组测序结果进行分析,发现其中属于EIN3/EIL1家族基因的序列Manes.13G091600.1受到显著诱导。对Manes.13G091600.1的序列进行引物设计并进行RT-PCR扩增,得到1个1 452 bp的片段 (图1),经过测序发现该基因编码483个氨基酸残基,命名为MeEIN3.1基因。MeEIN3.1蛋白预测的分子式为C2405H3745N669O766S26,理论等电点为5.08,分子质量55.12 ku,不稳定系数为54.58,预测为不稳定蛋白。将MeEIN3.1基因序列与木薯基因组进行比对发现,该基因不包含内含子,只有1个外显子。对MeEIN3.1蛋白序列进行二级结构预测显示,α-螺旋占比40.79%,β-转角占比7.25%,无规则卷曲占比为40.58%,延伸链占比11.39%。对MeEIN3.1蛋白序列进行三级结构预测(图2),其含有EIN3家族结构域(图3)。以上预测分析结果证明,克隆得到的MeEIN3.1基因属于EIN3/EIL1基因家族的成员。

M:DNA maker;1:样品;2:模板为水。

图3 结构域分析Fig.3 Analysis of conserved domain

2.2 MeEIN3.1氨基酸序列同源性和系统发育

在NCBI数据库中,将MeEIN3.1基因的蛋白序列进行blast比对,发现了其他物种中与MeEIN3.1基因蛋白序列相似性较高的基因(一致性大于50%),其中与橡胶树中的EIN3-like基因(XP_021687399.1)的一致性最高,达到69.35%。从图4可以看出,MeEIN3.1蛋白序列和其他EIN3蛋白序列一致性不高,但它们都包含EIN3/EIL1基因家族的结构特征。EIN3/EIL1基因家族的N端具有高度保守性,包含多个保守的EIN3结构域,如酸性氨基酸区(AD)、碱性氨基酸簇(BD Ⅰ、BD Ⅱ、BD Ⅲ、BD Ⅳ、BD Ⅴ)以及脯氨酸富集区(PR),而C端的保守性较低。这些结果证明,MeEIN3.1属于EIN3/EIL1基因家族,与橡胶树中的EIN3-like基因(XP_021687399.1)相似性最高,在同一进化分支上(图5),都属于大戟科植物。

MeEIN3.1木薯;XP_021687399.1橡胶树;XP_002533137.1蓖麻;XP_022752027.1榴莲;AVR43713.1陆地棉;XP_027337569.1红豆;XP_040874091.1大豆;KHN29080.1野生大豆;XP_011090514.1芝麻;XP_022929461.1南瓜;XP_022984791.1印度南瓜。

*表示MeEIN3.1蛋白。

2.3 MeEIN3.1蛋白亚细胞定位

亚细胞在线预测软件Softberry和WoLF PSORT servers的预测结果显示,MeEIN3.1蛋白定位于细胞核。随后,将MeEIN3.1基因的CDS序列连接至载体pNC-Green-subC,构建了pNC-Green-subC-MeEIN3.1植物表达载体。通过农杆菌侵染的方法,在烟草叶片中进行了亚细胞定位试验。结果表明,绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)在细胞核中表达,说明转录因子MeEIN3.1定位于细胞核(图6)。

图6 MeEIN3.1蛋白亚细胞定位Fig.6 Subcellular localization of MeEIN3.1 protein

2.4 MeEIN3.1基因在PPD过程中的表达

为研究MeEIN3.1基因在木薯PPD过程中的功能,对MeEIN3.1基因在木薯块根PPD不同阶段的表达情况进行了分析。结果表明(图7),MeEIN3.1基因的表达量在PPD过程中呈现上调的趋势;和0 h相比,在6、12、48 h分别提高了1.7、4.5、6.7倍。表明MeEIN3.1基因的表达在木薯PPD过程中受到诱导,推测其在PPD调控过程中发挥了作用。

*代表与0 h差异显著(P<0.05)。

2.5 酵母双杂交互作试验

乙烯信号通路中积累的EIN3/EIL1能以同源二聚体的形式与ERF1转录因子相结合开始乙烯信号响应,因此,本试验运用酵母双杂交试验鉴定MeEIN3.1基因与乙烯信号通路下游关键转录因子ERF之间的互作关系。将MeEIN3.1基因和实验室已克隆得到并在PPD过程中被显著诱导的4个木薯MeERFs转录因子构建到pGADT7和pGBKT7载体中,并扩增得到重组质粒。根据EIN3/EIL1与ERFs的互作关系验证结果(图8),所有组合在DDO培养基上正常生长。在TDO培养基上,MeEIN3.1+MeERF1.2、MeEIN3.1+MeERF1.3和阳性对照pGADT7-T+pGBKT7-5形成了菌落,并在X-α-Gal染料下呈现出蓝色,2个试验组合的生长状态和染色程度与阳性对照类似;而MeEIN3.1+MeERF1.1和MeEIN3.1+MeERF1.4组合及pGADT7-T+pGBKT7-Lam阴性对照则无菌落产生。初步推测MeEIN3.1与下游转录因子MeERF1.2和MeERF1.3存在互作。

3 讨论

EIN3/EIL1是乙烯信号途径中起正调控作用的信号因子,是乙烯信号转导通路中的主要成员,不同物种中的EIN3/EIL1数量各不相同。对EIN3/EIL1的功能进行分析研究,能够进一步解析乙烯信号转导通路及其功能,具有重要意义[16-18]。实验室前期的转录组数据显示MeEIN3.1基因在木薯块根PPD过程中被显著诱导。因此,本试验从木薯中克隆了MeEIN3.1基因,MeEIN3.1基因的蛋白质序列显示含有483个氨基酸残基,保守结构预测显示含有EIN3家族结构域,具有多个保守的EIN3结构域,可以确定该基因属于EIN3/EIL1基因家族。亚细胞定位结果显示MeEIN3.1蛋白定位于细胞核,符合转录因子的功能定位[19]。进化关系显示MeEIN3.1和橡胶树EIN3蛋白的进化关系较近。这些结果都证明MeEIN3.1基因属于植物EIN3/EIL1家族。

木薯是重要的粮食和经济作物之一,但PPD现象影响了其在规模化生产中的利用。本课题组的前期研究表明,乙烯处理能够延缓木薯块根PPD现象的进程。MeEIN3.1基因与乙烯信号途径密切相关,其深入研究对探明乙烯信号调控木薯PPD的分子机制具有重要意义。现有研究显示EIN3/EIL1基因家族参与了不同非生物逆境胁迫的响应,例如干旱和盐胁迫等[2,4,12]。乙烯信号的转导和果实的成熟密切相关。在番茄和香蕉中研究显示,EIN3/EIL1作为乙烯信号转导途径的重要成员,在启动调控乙烯目标基因的过程中发挥重要作用[25-27]。木薯块根PPD现象的发生往往伴随着活性氧的大量产生,因此,降低活性氧的含量能够延缓PPD过程[24,28]。拟南芥AtEIN3基因可以通过正向调控过氧化物酶基因POD的表达以减少活性氧的积累,进而提高植株的耐盐性[29]。而MeEIN3.1基因在PPD过程中的表达显著受到诱导,并且在乙烯处理块根的过程中也显著被诱导。因此,推测乙烯调控抗氧化系统信号的转导是通过MeEIN3.1基因进行的。ERF1是乙烯信号通路中重要的转录因子,负责将信号转导至下游目标调控基因,在生长发育、应激反应等多种生物学过程中起着重要调控作用[8-10]。有研究表明,积累在乙烯信号通路中的EIN3/EIL1可以通过与转录因子ERF1相结合来启动乙烯响应[20-22]。酵母双杂交试验显示,MeEIN3.1与MeERF1.1和MeERF1.4的组合在TDO缺陷培养基上不能正常生长,而MeEIN3.1与MeERF1.2和MeERF1.3的组合在TDO缺陷培养基上可以正常生长且菌落呈蓝色,因此推测MeEIN3.1很可能是通过下游关键转录因子MeERF1.2和MeERF1.3进行信号转导的[10]。MeEIN3.1定位于细胞核也证明其具备与其他转录因子互作的条件。由此推测,MeEIN3.1基因参与了乙烯信号在木薯PPD过程中的转导。以上结果为进一步研究乙烯信号如何延缓PPD过程提供了参考,并为培育高抗PPD过程的木薯新品种提供了方向。

致谢：感谢李丹丹女士在论文撰写过程中的校对工作。