东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中nce-miR-15338及候选靶基因的表达谱

王思懿, 高旭泽, 赵浩东, 荆 欣, 刘小玉, 冯佩林, 宋宇轩, 刘彩珍, 陈大福,3,4, 郭 睿,3,4

[1.福建农林大学动物科学学院(蜂学学院),福建 福州 350002; 2.福建农业职业技术学院现代农业工程学院,福建 福州 350000; 3.福建农林大学天然生物毒素国家地方联合工程实验室,福建 福州 350002; 4.福建省蜂疗研究所,福建 福州 350002]

意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica),简称意蜂,是西方蜜蜂(A.mellifera)的一个优良亚种。由于其具有分蜂性弱、繁殖力强、工蜂采集力强以及对大群的维持能力等优良特性,成为养蜂生产中主要的蜂种[1]。东方蜜蜂微孢子虫(Nosemaceranae)专性侵染成年蜜蜂的肠上皮细胞,导致宿主细胞结构破坏、免疫抑制和能量胁迫等,严重影响蜜蜂的健康和蜂群的生产力[2]。Fries et al[3]在北京附近的东方蜜蜂(Apiscerana)蜂群中鉴定到东方蜜蜂微孢子虫。东方蜜蜂微孢子虫已在欧洲和北美地区饲养的西方蜜蜂蜂群中传播[4-5],目前可以在世界各国的饲养蜂群中检测到东方蜜蜂微孢子虫。

微小RNA(microRNA, miRNA)是一类长度18～22 nt的小非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA),在众多生理和病理过程中发挥着重要的调控作用[6]。Lee et al[7]于1993年在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)中发现1个miRNA并命名为lin-4。随着二代测序技术的发展与成熟,三角涡虫(Dugesiajaponica)、小麦(Triticumaestivum)和东方蜜蜂微孢子虫等动植物和微生物的miRNA被陆续鉴定[8-10]。目前,动植物的miRNA研究丰富而深入,但真菌的miRNA研究相对滞后[11-12]。蜜蜂真菌病原的miRNA相关研究相对较少。Huang et al[13]利用RNA-seq技术对东方蜜蜂微孢子虫侵染的西方蜜蜂6日龄工蜂中肠进行测序,预测到东方蜜蜂微孢子虫的6个miRNA。基于新组装的东方蜜蜂微孢子虫基因组,Shao et al[14]随后又鉴定出3个miRNA。本课题组结合small RNA-seq和生物信息学鉴定到nce-miR-15338等东方蜜蜂微孢子虫孢子中的10个miRNA[15],并通过分子生物学方法证实了其中4个miRNA(nce-miR-23928、nce-miR-26675、nce-miR-12220和nce-miR-10660)的真实存在和表达[15-16]。

目前,关于东方蜜蜂微孢子虫的miRNA研究相对滞后且信息匮乏。nce-miR-15338在东方蜜蜂微孢子虫侵染蜜蜂宿主过程中的表达规律和调控尚不明确。本研究对nce-miR-15338进行表达和序列验证,并进行nce-miR-15338的靶向预测和分析,进而检测nce-miR-15338及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意蜂工蜂过程中的表达谱,以明确nce-miR-15338及其靶基因在侵染过程中的表达规律,并为探究nce-miR-15338调控东方蜜蜂微孢子虫侵染的功能及作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试生物材料

未受东方蜜蜂微孢子虫感染的工蜂取自福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)教学蜂场的意蜂蜂群。东方蜜蜂微孢子虫感染的工蜂取自福州市闽侯县荆溪源安蜂场的意蜂蜂群。东方蜜蜂微孢子虫孢子由福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)蜜蜂保护实验室制备和保存[15,17]。

1.2 nce-miR-15338的Stem-loop RT-PCR、分子克隆及Sanger测序

根据前期预测到的nce-miR-15338序列(UAGUGAUGGCUGUGGCCUAGA),利用DNAMAN软件设计Stem-loop引物和上下游引物(表1),并由上海生工生物工程股份有限公司进行合成。利用RNA抽提试剂盒(Promega Corporation,美国)提取东方蜜蜂微孢子虫纯净孢子的总RNA。参照反转录试剂盒(艾科瑞生物工程有限公司,长沙)说明书,利用Stem-loop引物进行反转录,以得到的cDNA作为模板进行PCR扩增。PCR体系与条件参照吴鹰等[18]的研究方法。参照郭意龙等[19]的方法回收目的片段和TA克隆,然后将少量菌液送至上海生工生物工程股份有限公司进行Sanger测序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 nce-miR-15338的靶基因预测和分析

基于前期获得的东方蜜蜂微孢子虫孢子高质量sRNA-seq数据[15],使用Target Finder软件[16]对nce-miR-15338进行靶向预测。参照吴鹰等[17]的方法,利用Blast工具将靶基因比对到Nr数据库(https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/FASTA)、Swiss-Prot数据库(http://www.ebi.ac.uk/swissprot)、GO数据库(https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/gogsea)及KEGG数据库(https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/pathwaygsea)以获得相应注释。根据预测到的靶向结合关系构建nce-miR-15338与靶基因之间的调控网络,并通过Cytoscape软件进行可视化分析。

1.4 样品制备

意蜂工蜂接种及中肠样品制备[20]:首先从群势较强、外观健康且未受东方蜜蜂微孢子虫感染的意蜂蜂群中提取封盖子脾至实验室,放入恒温恒湿箱[(温度为(34±0.5) ℃,相对湿度为70%)];随后,收集刚羽化的工蜂,经过2 h的饥饿处理后,单头饲喂接种5 μL 500 g·L-1蔗糖溶液(含106个东方蜜蜂微孢子虫孢子)。工蜂食尽蔗糖溶液后,将其放入干净的塑料盒(每盒35头),并在上方安放1支饲喂器(内装有2 mL蔗糖溶液)。每24 h更换1支饲喂器(内装有2 mL蔗糖溶液),并每日检查工蜂的死亡情况,及时清理死亡工蜂。在接种后的第1、2、4、6、8天,使用眼科镊取出工蜂中肠,每3条中肠放入1个无菌的RNA-Free离心管,液氮速冻后迅速转移至-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.5 nce-miR-15338的RT-qPCR检测

利用RNA抽提试剂盒(Promega Corporation,美国)分别提取上述5个时间点的中肠样品总RNA,利用Stem-loop引物进行反转录得到相应的cDNA,作为nce-miR-15338的qPCR模板。 同时将Oligo dT引物和Random 6 mer引物按1∶1混合,通过反转录获得相应的cDNA作为nce-miR-15338的内参5srRNA(GenBank ID: EF091880.1)、靶基因及靶基因内参actin(GenBank ID: 36320842)的qPCR模板。按照SYBR Green试剂的说明书进行qPCR反应。参照吴鹰等[18]试验体系。每个反应均设置3个平行重复和3个技术重复。以1 d为参照,采用2-ΔΔCt法计算nce-miR-15338在2、4、6和8 d的相对表达量。 采用GraphPad Prism 8软件进行数据分析并绘图。使用SPSS statistics软件对nce-miR-15338在各日龄的相对表达量进行单因素方差分析,以P<0.05为显著性阈值。通过Tukey检验法和字母显著标记法两两比较分析试验数据。

1.6 靶基因的RT-qPCR检测

根据1.3节的靶向预测结果和东方蜜蜂微孢子虫的生物学背景[21],同时参考相关研究报道[22],筛选出2个关键靶基因长链脂肪酸连接酶(long chain fatty acid ligase)编码基因LCFAL2(GenBank ID: 36321219; gene 1366)和20s蛋白酶体亚基(20s proteasome subunit)基因20sPS(GenBank ID: 36320219; gene 1677)进行表达谱检测。 根据LCFAL2和20sPS的序列设计并合成相应的特异性引物(表1)。 采用qPCR检测上述2个靶基因的相对表达量。 以肌动蛋白基因actin(GenBank ID: AB023025.1)作为内参。 参照吴鹰等[18]的试验体系。每个反应均设置3个技术重复和3个平行重复。以1 d为参照,采用2-ΔΔCt法计算靶基因在2、4、6、8 d的相对表达量。利用GraphPad Prism 8软件进行数据分析并绘图。

2 结果与分析

2.1 nce-miR-15338的表达与序列验证

琼脂糖凝胶电泳结果表明,Stem-loop RT-PCR能够扩增出符合预期(约100 bp)的目的片段(图1A);进一步的Sanger测序结果显示,目的片段的序列(UAGUGAUGGCUGUGGCCUAGA)与基于转录组数据预测的nce-miR-15338序列完全一致(图1B),表明nce-miR-15338真实存在和表达。

A:nce-miR-15338 Stem-loop RT-PCR扩增产物检测;B:目的片段的Sanger测序。

2.2 nce-miR-15338的靶基因

nce-miR-15338共靶向16个基因,形成相应的调控网络(图2)。这些靶基因在Nr数据库中均有注释,其中,有7个靶基因可注释到Swissprot数据库,注释信息包括蛋白酶体亚单位β-3型、锰转运ATP酶、苯丙氨酸-tRNA连接酶、T复合蛋白、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、长链脂肪酸-辅酶A连接酶和热休克蛋白。此外,有3个靶基因在KEGG数据库中有注释,涉及7条通路,包括脂肪酸生物合成、脂肪酸降解、群体感应、脂肪酸代谢、氨酰基-tRNA的生物合成、蛋白酶体和代谢途径。另外,有8个靶基因在GO数据库中有注释,涉及生物学进程、细胞组分和分子功能大类相关的28个功能条目,包括定位、单一组织进程和代谢进程等。

图2 nce-miR-15338及其靶基因之间的调控网络Fig.2 Regulatory network between nce-miR-15338 and its target genes

2.3 nce-miR-15338的表达谱

RT-qPCR结果显示,相比于1 d,nce-miR-15338在2 d的表达水平极显著上调1.66倍(P<0.01),在4、6、8 d的表达水平均极显著下调(P<0.01),下调99.23%、99.85%和99.85%。总体呈现先上升后下降的表达趋势(图3)。

t表示接种后的天数。曲线上相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(Tukey检验)。

2.4 靶基因LCFAL 2的表达谱

RT-qPCR结果显示,相比于1 d,靶基因LCFAL2在2、4、6、8 d的表达量均极显著下调(P<0.01),下调31.68%、98.41%、98.42%和98.86%(图4B)。总体表现出持续下降的表达趋势(图4B)。

t表示接种后的天数。A:nce-miR-15338与LCFAL 2的靶向结合关系;B:LCFAL 2在东方蜜蜂微孢子虫侵染过程的表达谱。曲线上相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(Tukey检验)。

2.5 靶基因20s PS的表达谱

20sPS(gene 1677)与nce-miR-15338的潜在靶向结合关系如图5A所示。与1 d相比,靶基因20sPS在2、4、6、8 d的表达量均极显著下调(P<0.01),下调45.91%、76.15%、71.27%和77.59%(图5B)。20sPS总体上呈现持续下降的表达趋势(图5B)。

t表示接种后的天数。A:nce-miR-15338与20s PS的靶向结合关系;B:20s PS在东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中的表达谱。曲线上相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(Tukey检验)。

3 讨论与结论

关于东方蜜蜂微孢子虫miRNA的研究相对较少,主要是基于生物信息学方法进行预测,而对miRNA的分子生物学验证以及功能研究则相对匮乏。在本研究中,利用Stem-loop RT-PCR和Sanger测序证实了nce-miR-15338在东方蜜蜂微孢子虫孢子中的真实存在和表达。此前,本课题组已经验证了东方蜜蜂微孢子虫孢子中nce-miR-23928、nce-miR-26675、nce-miR-12220和nce-miR-10660的存在和表达[15,18]。鉴于目前东方蜜蜂微孢子虫miRNA序列的信息较少,以上结果为miRNA序列信息的丰富提供了重要补充。本研究表明,nce-miR-15338在2 d的表达量显著高于1 d,而在4、6、8 d的表达量则显著下调,说明nce-miR-15338在东方蜜蜂微孢子虫侵染意蜂工蜂的过程中发生了差异表达,因此nce-miR-15338可能参与了对东方蜜蜂微孢子虫侵染的调控。

长链脂酰辅酶A合成酶(long-chain acyl-CoA synthetase, LACS)是酰基激活酶家族成员之一,包含5种不同的亚型,由不同的基因编码,在真核生物中广泛存在,且在细胞的脂质代谢、增殖以及凋亡中起到重要作用[23-24]。Tomoda et al[25]研究表明,将Raji细胞在含LACS的抑制剂中培养时,细胞增殖以剂量依赖性方式受到抑制,且酰基辅酶A合成酶的抑制与脂质合成的抑制密切相关。Schoonjans et al[26]通过部分肝切除试验发现,72 h后肝细胞中的LACS mRNA恢复到术前70%,表明LACS与肝细胞增殖之间存在实质性联系。本研究中,nce-miR-15338与LCFAL2存在潜在靶向结合关系(图4A),而LCFAL2在2、4、6和8 d的表达水平分别下调了31.68%、98.41%、98.42%和98.86%(图4B),暗示其潜在参与侵染过程。另外,nce-miR-15338的表达趋势与LCFAL2在4、6、8 d一致,二者之间可能存在潜在的正调控关系,但仍需通过双荧光素酶报告基因系统进一步验证。

蛋白酶体存在于真核动物、古细菌和细菌中,以20s蛋白酶体核心颗粒为中心的复合物,在细胞核和细胞质中具有蛋白水解和细胞代谢等重要功能[27]。另外,蛋白酶体亚基的一种新型磷酸位点α5-S16能够与关键调节因子PLK1等许多蛋白质共同作用进而影响有丝分裂[28]。在小鼠中,免疫蛋白酶体亚基通过影响CD8+T淋巴细胞的反应加强宿主对布鲁氏菌(Brucellaabortus)的抵抗[29]。本研究发现,nce-miR-15338与20sPS存在潜在靶向结合关系(图5A),相较于1 d,20sPS在2、4、6、8 d分别极显著下调了45.91%、76.15%、71.27%和77.59%(图5B),表明20sPS在东方蜜蜂微孢子虫的侵染过程中持续下调表达,推测其参与侵染过程。此外,20sPS在4、6、8 d的表达趋势与nce-miR-10660一致,二者间同样具有潜在的正调控关系,但仍需要进一步的试验验证。下一步拟利用双荧光素酶报告基因系统验证nce-miR-10660与上述2个靶基因之间的结合关系,再通过饲喂dsRNA对孢子接种的工蜂体内的东方蜜蜂微孢子虫LCFAL2(20sPS)进行RNAi,进而检测病原孢子载量、增殖和侵染相关基因相对表达量及宿主生存曲线、蔗糖溶液消耗量等指标,以明确LCFAL2和20sPS在侵染中的功能。

综上,研究结果证实了nce-miR-15338在东方蜜蜂微孢子虫孢子中的真实存在和表达,并明确了nce-miR-15338及其靶基因LCFAL2和20sPS在东方蜜蜂微孢子虫侵染意蜂工蜂过程中的表达规律和潜在调控关系。