基于Fe3O4@CeO2 过氧化物模拟酶的尿酸检测★

韩素平，李晓红，徐宁宁，付 正*

（1.山东医学高等专科学校药学系，山东 济南 250002；2.济南护理职业学院专业基础部，山东 济南 250102；3.宏济堂制药（商河）有限公司，山东 济南 251600）

尿酸是白血病、恶性肿瘤化疗以及心脑血管疾病的风险监测因子，因此，尿酸的检测备受关注[1]。目前，临床和实验室用于尿酸检测的方法存在操作复杂、成本高、稳定性差等问题[2]。

天然过氧化物酶结构不稳定、重复利用率低且价格高，而纳米模拟酶在模拟天然酶活性的同时可弥补天然酶的不足，在诸多具有类酶活性的纳米材料中，磁性Fe3O4因具有成本低、表面易功能化和良好的生物学兼容性受到研究人员的青睐[3]。本文通过两步水热法制备了Fe3O4@CeO2模拟酶，并通过与尿酸酶的催化反应级联，实现尿酸高灵敏度、高选择性、低成本、快速的可视化检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

透射电子显微镜，FEI Tecnai F20，赛默飞；紫外-可见分光光度计，UV-2450，岛津；pHS-25 酸度计，雷磁。

尿酸和尿酸氧化酶，上海鼓臣生物技术有限公司；3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）、H2O2，上海国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸三钠、乙二醇、醋酸、醋酸钠、六水合硝酸铈、氯化铁、乙醇、六亚甲基四胺等，上海泰坦科技股份有限公司。实验中所用水为超纯水。

1.2 过氧化物模拟酶的制备

将0.202 5 g 柠檬酸三钠和0.651 3 g 氯化铁充分溶解于20 mL 乙二醇后加入1.253 7 g 醋酸钠，磁力搅拌20 min 混匀，转移至反应釜，在200 ℃水热反应10 h。冷却至室温后分别用超纯水、无水乙醇洗涤沉淀3 次并磁分离收集，60 ℃真空干燥，得到Fe3O4纳米粒子。

取0.100 3 g 以上所得Fe3O4纳米粒子分散至40 mL 50%的乙醇中，加入35 mg 六水合硝酸铈和30 mg 六亚甲基四胺后转移到反应釜中，在100 ℃下反应2 h。冷却后分别用超纯水、无水乙醇洗涤沉淀3 次并磁分离收集，60 ℃真空干燥得到Fe3O4@CeO2过氧化物模拟酶。

1.3 Fe3O4@CeO2 模拟酶活性的探究

向盛有100 μL 5 mmol/L TMB 溶液的离心管中分别加入2 mL 醋酸钠缓冲液（pH=4.0，0.2 mol/L）、10 μL 0.5 mg/mL 的Fe3O4@CeO2和10 μL 50 mmol/L的H2O2，37 ℃水浴中反应20 min 后磁分离去除Fe3O4@CeO2，上清液转移到吸收池中测量吸收光谱。

1.4 尿酸的比色检测

尿酸检测参考文献[4]的方法，第一步，将10 μL 10 g/L 的尿酸氧化酶和200 μL 不同浓度的尿酸分散在pH=8.4 的硼酸盐缓冲液中，混合液在37 ℃水浴中反应20 min；第二步，10 μL 0.5 mg/mL 的Fe3O4@CeO2、100 μL 的TMB（5 mmol/L）、2 mL 醋酸钠缓冲溶液（0.2 mol/L，pH=4.0）加入到第一步中的尿酸反应液中充分混匀，37 ℃水浴中反应20 min，磁分离Fe3O4@CeO2后测吸收光谱。

2 结果与讨论

2.1 Fe3O4@CeO2 的表征与模拟酶特性研究

按照1.2 步骤所制备的Fe3O4@CeO2的透射电子显微镜图见图1，CeO2纳米粒子均匀负载在Fe3O4纳米粒子表面形成分散性良好的核壳结构的Fe3O4@CeO2。

图1 Fe3O4@CeO2 纳米复合物的TEM 图

2.2 Fe3O4@CeO2 过氧化物模拟酶特性研究

以TMB 为反应底物，H2O2为氧化底物，评价所制备Fe3O4@CeO2的过氧化物模拟酶特性。结果表明，H2O2不能单独氧化TMB 使其变色；Fe3O4@CeO2和TMB 共存时，652 nm 处无明显吸收；Fe3O4@CeO2、TMB 和H2O2共存的反应体系在652 nm 处有较强吸收，证明生成了蓝色的TMB 氧化产物。以上结果表明Fe3O4@CeO2具有良好的类过氧化物酶活性。

纳米模拟酶和天然酶辣根过氧化物酶的催化活性均受体系pH 值影响[5]。实验了pH 从2 到10 变化对Fe3O4@CeO2类过氧化物酶催化性能的影响。结果表明，当pH=4 时，652 nm 处吸光度值最大，证明此时Fe3O4@CeO2的催化活性最强。因此，实验选择pH=4作为该纳米模拟酶催化反应的最佳pH 值。

研究了底物H2O2在不同浓度下Fe3O4@CeO2对TMB-H2O2体系的催化效果，图2、图3 表明，Fe3O4@CeO2的催化活性随H2O2浓度的增加先增大后趋于稳定，在1～20 μmol/L 范围内的线性方程为A=0.012 22+0.012 1c，r=0.999（c 为H2O2浓度，A 为652 nm 处吸光度值）。

图2 不同H2O2 浓度条件下652 nm 处的吸光度值

图3 H2O2 的线性工作曲线

2.3 尿酸的测定

根据Fe3O4@CeO2能够催化氧化过氧化物酶底物的酶学特性，与尿酸氧化酶催化氧化尿酸的反应耦合，通过直接检测H2O2从而实现尿酸的间接测定。图4为该方法检测尿酸的吸收光谱，652 nm 处吸收峰随尿酸浓度的增加而增大，在10～100 μmol/L 范围内，尿酸浓度与吸光度呈线性，线性方程为A=0.172+0.002 96c，r=0.992（c 为尿酸浓度，A 为652 nm 处吸光度值），检测限为7.9 μmol/L。

图4 不同尿酸浓度下TMB-H2O2 体系的吸收光谱

血清样品高速离心后取上清液稀释20 倍后做加标回收实验，回收率为83%～105%，相对标准偏差（RSD）为5.25%，表明该方法准确度良好，可用于尿酸浓度的检测。

3 结论

本研究通过两步水热法制备具有优异催化活性的Fe3O4@CeO2磁性过氧化物模拟酶，并与尿酸氧化酶级联构建尿酸的酶催化反应体系，实现尿酸高选择性、低成本的比色检测，测定尿酸的线性范围为10～100 μmol/L，检测限为7.9 μmol/L，为尿酸检测提供了一种新思路。