QuEChERS 结合优化的超高效液相色谱-串联质谱法快速测定韭菜中9 种易残留农药

王 晗，丁 爽，李海平

（钢研纳克检测技术股份有限公司，北京 100081）

韭菜属多年生宿根性蔬菜，富含蛋白质、纤维素、多种维生素、微量元素等营养物质，深受消费者喜爱，市场需求量巨大[1]。然而韭菜极易遭受病害侵袭，尤其在大棚温室等冬春季韭菜生产地中，韭菜灰霉病、韭蛆等危害尤为突出[2]。为保证韭菜的产量和质量，药剂防治仍是目前田间防控该病害较常采用的措施[3]。这些农药主要以灌根的方式投入韭菜生产，导致土壤中残留的农药量非常大，从土壤环境中吸收农药后的韭菜被消费者食用后，产生急性中毒事件时有曝光，造成了非常不好的社会影响[4]。相关研究显示[5-7]，相比于其他农药，多菌灵、腐霉利、吡虫啉、啶虫脒、乙酰甲胺磷、毒死蜱、甲胺磷、二甲戊灵、氧乐果这9 种农药在韭菜中更易残留，当前亟需建立一种简单、快速、高效的方法，针对性地用于检测韭菜中的易残留农药。

目前，常见的农残检测技术主要有气相色谱法[8-9]、液相色谱法[10-11]、气相色谱-质谱法[12-13]、气相色谱-质谱/质谱法[14-15]和液相色谱-质谱/ 质谱法[16-17]。其中，气相色谱法、液相色谱法对前处理要求高、定性能力弱、适用范围窄，而且抗干扰能力差，容易引起假阳性；气相色谱-质谱法为低分辨质谱，当样品基质复杂时，特别是质荷比接近的目标物和干扰物不能有效地区分，同样会出现假阳性而造成误判；而气相色谱-质谱/质谱法和液相色谱-质谱/质谱法，通过选择反应监测扫描或多反应监测扫描，选择特征母离子与子离子，可有效减少基质对检测结果的影响，现逐渐发展为农药多残留分析的主要检测技术[18]。但相比于气相色谱-质谱/质谱法，液相色谱-质谱/质谱法对于前处理的要求更低且耗时更短。

常用的农残前处理方法主要有固相分散萃取法、固相萃取法、凝胶渗透色谱法以及QuEChERS 法，韭菜的基质十分复杂，在其农药残留检测过程中，传统的样品前处理技术不易实现基质成分的有效净化，对农药检测容易产生基质效应，影响测定结果的准确性[19]。QuEChERS 法通过吸附剂填料与基质中杂质的相互作用来达到吸附除杂的目的，其前处理简便、快速，现已成为动植物性食品中农药残留的主要前处理技术之一。

本研究采用超高效液相色谱-串联质谱法，结合QuEChERS 前处理技术，针对韭菜中容易检出的多菌灵、腐霉利、吡虫啉、啶虫脒、乙酰甲胺磷、毒死蜱、甲胺磷、二甲戊灵、氧乐果等农药，建立了一种适用于检测韭菜中上述9 种农残的分析方法，仪器检测时间仅需4 min，定性定量准确，方法简便快捷，大大提高了检测效率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

阴性韭菜粉，钢研基地自产；多菌灵、腐霉利、吡虫啉、啶虫脒、乙酰甲胺磷、毒死蜱、甲胺磷、二甲戊灵、氧乐果的标准溶液，含量均为1 000 mg/kg，坛墨质检；乙腈、甲醇、甲酸，均为色谱纯，阿拉丁试剂公司；乙酸铵、无水硫酸镁、氯化钠，麦克林；乙二胺-N-丙基硅烷/PSA、石墨化炭黑/GCB，山东美正生物科技有限公司；50mL 离心管，广州洁特生物过滤股份有限公司；实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱，Waters UPLC-AB SCIEX QTRAP 5500，配电喷雾离子源，美国AB SCIEX；多孔涡旋振荡器，北京华安麦科生物技术有限公司；IKA 漩涡混合器，艾卡仪器设备有限公司；滤膜，0.22 μm，上海安谱实验科技股份有限公司；1/100 电子天平，瑞士梅特勒-托利多集团；TD5 台式低速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

称取1 g 阴性韭菜粉，加入9 mL 超纯水，复溶成10 g 韭菜样本。向其中加入10 mL 乙腈，加入4 g 无水硫酸镁、1 g 氯化钠，剧烈振荡15 min，4 000 r/min离心5 min，取4 mL 上清液倒入装有0.6 g 无水硫酸镁、0.1 g PSA、0.01 g GCB 的离心管中，剧烈振荡3 min，4 000 r/min 离心5 min，上清液过0.22 μm 有机滤膜备用。

1.3.2 仪器条件

色谱条件：ACQUITY UPLCD HSS C18 SB 色谱柱，粒径1.8 μm，100 mm×2.1 mm，美国Waters 公司；流动相组成及洗脱梯度如表1 所示；柱温40 ℃；流速为0.40 mL/min；进样量1 μL。

表1 流动相组成及洗脱梯度

质谱条件，电离方式：ESI+；MRM 多反应监测模式；离子化电压：5 500 V；气帘气压力35 psi；干燥气温度：550 ℃；喷雾器压力：55 psi；辅助加热器压力：55 psi；定性离子对、定量离子对及碰撞能量见表2。

表2 9 种农药在UPLC-MS/MS 多反应监测模式下的检测条件

1.3.3 标准曲线绘制及基质效应

溶剂标准曲线的配制：准确移取质量浓度均为1 000 mg/L 的9 种农药标准溶液各10 μL，用乙腈配制成质量浓度为10 mg/L 的混合标准中间液，于-20 ℃保存，备用。再以质量浓度为10 mg/L 的混合标准中间液为母液，用乙腈逐级稀释成质量浓度为0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L 的系列混合标准工作液。按照1.3.2 的条件上机测定，以标准溶液中待测农药的质量浓度为横坐标，以待测农药的峰面积为纵坐标，通过Analyst software 绘制溶剂标准曲线。

基质匹配标准曲线的配制：以质量浓度为10 mg/L的混合标准中间液为母液，用1.3.1 中处理得到的韭菜阴性基质液逐级稀释成质量浓度为0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L 的系列基质匹配混合标准工作液。按照1.3.2 的条件上机测定，以基质匹配标准溶液中待测农药的质量浓度为横坐标，以待测农药的峰面积为纵坐标，通过Analyst software绘制基质匹配标准曲线。

基质效应评价：本文通过计算基质标准曲线和溶剂标准曲线的线性方程[式（1）]斜率比进行基质效应（ME）评价。

根据ME 为正值还是负值评价基质效应为增强或减弱效应。其中，当-20%＜ME＜20%时，通常认为是弱基质效应；当-50%＜ME＜-20%或20%＜ME＜50%时，为中等程度基质效应；当ME＜-50%或50%＜ME时，为强基质效应；中等程度基质效应和强基质效应都需要进行基质补偿[21]。

1.3.4 添加回收率实验

称取阴性韭菜样品，设定10、50、100、200 μg/kg 4 个添加水平，每个添加水平设置6 个重复，另设空白对照，按照1.3.1 所述的方法进行前处理，按照1.3.2的条件上机测定，计算添加回收率和相对标准偏差。

2 结果与讨论

2.1 质谱参数及流动相的优化

本实验在ESI+模式下，用针泵以7.5 μL/min 的流速将质量浓度为500 μg/L 的9 种农残单标注入质谱仪，进行全扫描，获得加合离子峰，以其作为母离子进行轰击，获得碎片离子。选择响应较强的2 个碎片离子和母离子组成2 对监测离子对。在MRM 多反应监测模式下，对碰撞能量（CE）、去簇电压（DP）等参数逐一进行优化。优化获得的MRM 离子对及质谱条件见表2。

本实验考察了：①水+甲醇、②水+乙腈、③0.1%甲酸水+甲醇、④0.1%甲酸水+乙腈、⑤2 mol/L 乙酸铵-0.1%甲酸水+甲醇，5 组不同流动相对化合物峰形和响应的影响。结果显示，使用流动相②、④时，腐霉利响应很低。使用流动相①、③、⑤时，9 种物质均能正常出峰，且响应信号逐渐升高，峰形也逐步得到改善。因此，本实验最终采用2 mol/L 乙酸铵-0.1%甲酸水+甲醇溶液作为流动相。甲酸的加入能提供H+质子，有助于化合物电离的同时也提高了背景化合物的响应。乙酸铵的加入使得流动相离子强度增加，电子转移速率增加，目标化合物和背景化合物同时抑制电离，乙酸铵在一定浓度下，可提高目标化合物的信噪比[22]。9 种农药混合标准溶液（10.0 μg/L）在韭菜样品基质中的提取离子流图见图1。

图1 9 种农药混合标准溶液在韭菜样品基质中的提取离子流图

2.2 基质效应

如表3 所示，腐霉利和甲胺磷表现为基质增强效应，二甲戊灵几乎没有基质效应，其余6 种农药在韭菜中均为基质减弱效应。根据基质效应对应范围，除氧乐果在韭菜中表现为中等程度基质效应外，其余农药基均为弱基质效应。

表3 9 种农药在韭菜中的基质效应

2.3 标准曲线线性的考察

综合考虑9 种化合物的基质效应，本实验采用基质匹配标准曲线进行定量，如表4 所示，多菌灵在1～200 μg/kg 范围内线性关系良好，线性系数为0.991 1，腐霉利在5～500 μg/kg 范围内线性关系良好，线性系数为0.999 1，其余7 种化合物在1～500 μg/kg范围内均呈现良好线性关系，线性系数在0.997 0～1.000 0 之间。

表4 9 种农药的线性方程、线性系数和线性范围

2.4 方法的回收率与精密度

如表5 所示，在10、50、100、200 μg/kg 4 个添加水平下，9 种农药在韭菜中的平均回收率在70%～115%之间，相对标准偏差在0.6%～6.7%之间，结果表明本试验所建立的方法具有良好的准确度和精密度，满足韭菜中易检出农残的分析检测要求。根据NY/T 788—2018[23]规定，以最低添加水平作为方法的定量限（LOQ），则9 种农药的定量限均为0.01 mg/kg，且均低于本实验研究的9 种农药在韭菜中的最高残留限量[24]。

表5 9 种农药的加标回收率及相对标准偏差（n=6）

3 结论

本研究采用QuEChERS 前处理方法结合超高效液相色谱-串联质谱法同时检测韭菜中多菌灵、腐霉利、吡虫啉、啶虫脒、乙酰甲胺磷、毒死蜱、甲胺磷、二甲戊灵、氧乐果9 种农药，建立了一种针对性检测韭菜中9 种易残留农药的方法。9 种农药中，多菌灵在1～200 μg/kg 范围内线性关系良好，腐霉利在5～500 μg/kg 范围内线性关系良好，其余7 种化合物在1～500 μg/kg 范围内线性关系良好，线性系数均大于0.99，方法的定量限为10 μg/kg。在10、50、100、200 μg/kg 添加水平的回收率在70%～115%之间，相对标准偏差在0.6%～6.7%之间（n=6）。本研究所建立的检测方法，前处理时间短，色谱及质谱条件经过优化，峰形好、化合物在仪器中的响应高，方法简单、快速、灵敏度、准确度、精密度均符合农药残留分析的要求，适用于韭菜样品中9 种易残留农残的检测。