右美托咪定减轻呼吸机相关性肺损伤模型大鼠肺组织损伤

韩惠晶，吴 红，葛 银，乔 娟

江苏省苏北人民医院 麻醉科，江苏 扬州 225001

机械通气在急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征等众多危重疾病中是急救和呼吸治疗的重要措施,也是全身麻醉常用的呼吸支持方法。然而过度机械通气可加重已有的肺损伤甚至引起急性肺损伤,又称为呼吸机相关性肺损伤(ventilator-associated lung injury, VILI)[1]。目前研究在肺保护性通气方面取得一定的进展,但也造成其他器官的功能性障碍,寻找新的治疗药物至关重要[2]。研究显示,RhoA/ROCK1信号通路参与了大鼠VILI的发生发展,抑制RhoA/ROCK1信号通路可以减轻大鼠肺损伤[3]。右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)具有抗炎作用,其治疗可以减轻炎性反应,减轻呼吸机诱导的肺损伤[4]。但右美托咪定能否通过调控RhoA/ROCK1信号通路减轻VILI有待进一步验证。本文主要探索右美托咪定对呼吸机诱导的肺损伤及RhoA/ROCK1信号通路的影响,以期为VILI的治疗提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

成年SPF级雄性SD大鼠(200～250 g)[长沙市天勤生物公司,SCXK(湘)2019-0014)];右美托咪定(江苏扬子江药业);ROCK激活剂溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)(Sigma-Aldrich公司);HE染色试剂盒(上海懋康生物公司);TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA试剂盒(上海碧云天生物公司);Bcl-2(Proteintech公司);Bax(CST公司);cleaved caspase-3、RhoA和ROCK1(Abcam公司);α-SMA(北京百奥莱博公司)。

1.2 方法

1.2.1 VILI模型构建与大鼠分组:所有大鼠腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠进行麻醉,经口气管插管连接呼吸机,除对照组外所有大鼠以高潮气量(high tidal volume,TV)22 mL/kg和零呼气末正压(zero positive end-expiratory pressure,PEEP)通气,呼吸速率为16～18次/min;对照组大鼠以6 mL/kg的潮气量和5 cm H2O的呼气末正压通气,呼吸速率为45～55次/min[5]。每分通气量(minute volume,MV)期间15 mg/kg·h-1戊巴比妥钠维持麻醉,MV 4 h结束,将大鼠放回笼子,并提供食物和水。本实验已经通过本院实验动物伦理委员会批准。将所有大鼠分为对照组(control组)、模型组(VILI组)、右美托咪定(DEX)低、高剂量组(DEX-L、DEX-H组)[6]、右美托咪定高剂量+溶血磷脂酸(LPA)组(DEX-H+LPA组)[7]。DEX-L、DEX-H组:麻醉完大鼠,将留置针插入尾静脉,MV前15 min分别尾静脉注射1、10 μg/kg的DEX,期间分别尾静脉注射1、10 μg/kg·h-1的维持剂量;DEX-H+LPA组:麻醉完大鼠,将留置针插入尾静脉,MV前15 min尾静脉注射10 μg/kg的DEX,期间尾静脉注射10 μg/kg·h-1的维持剂量,另外在MV和DEX输注前30 min腹腔注射40 μg/kg LPA。最终每组选取24只大鼠进行后续实验。

1.2.2 ELISA检测炎性因子:机械通气结束后各组随机选择6只大鼠放血处死,低温迅速取出右肺组织,结扎左主支气管灌洗右肺,采集BALF,离心取上清,ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。

1.2.3 肺组织湿/干质量比值的测定:随机选取6只大鼠右肺组织清洗干净,干净纱布吸干水分后称其质量即湿质量(W),烘干箱将其烘干称其质量即为干质量(D),两者比值即为W/D。

1.2.4 HE染色检测肺组织损伤:从各组剩余大鼠中随机选择6只处死取右肺,4%多聚甲醛固定,乙醇脱水、透明、石蜡包埋、切片。HE染色后封片,显微镜观察并对肺损伤进行评分。双盲法根据肺泡毛细血管充血、出血、炎性细胞浸润、肺泡壁厚度4项评分:0分,无损伤;1分,轻度损伤(病变范围<25%);2分,中度损伤(病变范围25%～50%);3分,重度损伤(病变范围51%～75%);4分,极重度损伤(病变范围>75%),肺损伤评分为四项指标分数相加[8]。

1.2.5 TUNEL染色检测细胞凋亡:收集剩余6只大鼠右肺,冷冻切片,TUNEL染色,DAPI染核,具体操作参照TUNEL试剂盒实验步骤,最后封片,荧光显微镜观察,计算细胞凋亡率(绿色荧光为凋亡细胞)。

1.2.6 Western blot检测蛋白质表达量:收集1.2.6剩余右肺组织,研磨并加入RIPA裂解液进行裂解,得到总蛋白质量,电泳、转膜、封闭,加入Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、RhoA、ROCK1、α-SMA一抗,4 ℃冰箱孵育过夜,加入相应二抗,室温孵育,随后ECL孵育,凝胶电泳仪拍照分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 右美托咪定对各组大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响

与对照组相比,VILI组大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P<0.05);与VILI组相比,DEX-L组、DEX-H组大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平依次降低(P<0.05);与DEX-H组大鼠相比,DEX-H+LPA组大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P<0.05)(表1)。

表1 各组大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较Table 1 Levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in BALF of each group were

2.2 右美托咪定对各组大鼠肺组织W/D的影响

与对照组相比,VILI组大鼠W/D升高(P<0.05);与VILI组相比,DEX-L组、DEX-H组大鼠W/D依次降低(P<0.05);与DEX-H组大鼠相比,DEX-H+LPA组大鼠W/D升高(P<0.05)(表2)。

表2 各组大鼠W/D比较Table 2 Comparison of W/D in each

2.3 右美托咪定对各组大鼠肺组织形态的影响

与对照组相比,VILI组大鼠肺组织结构异常,肺泡壁增厚,肺间质与肺泡间隙有大量炎性细胞浸润,肺损伤严重,肺损伤评分升高(P<0.05);与VILI组相比,DEX-L组、DEX-H组大鼠肺组织结构趋于正常,肺泡壁厚度减少,炎性细胞浸润量明显减少,肺损伤减轻,肺损伤评分依次降低(P<0.05);与DEX-H组大鼠相比,DEX-H+LPA组大鼠肺组织结构遭到破坏,肺泡壁增厚,肺间质与肺泡间隙炎性细胞浸润增多,肺损伤加重,肺损伤评分升高(P<0.05)(图1,表3)。

Arrows indicated pathological injury of lung tissue.

表3 各组大鼠肺损伤评分

2.4 右美托咪定对各组大鼠肺组织细胞凋亡的影响

与对照组相比,VILI组大鼠肺组织TUNEL阳性细胞增多,细胞凋亡率、Bax、cleaved caspase-3表达升高,Bcl-2表达降低(P<0.05);与VILI组相比,DEX-L组、DEX-H组大鼠肺组织TUNEL阳性细胞依次减少,细胞凋亡率、Bax、cleaved caspase-3表达依次降低,Bcl-2表达依次升高(P<0.05);与DEX-H组大鼠相比,DEX-H+LPA组大鼠肺组织TUNEL阳性细胞增多,细胞凋亡率、Bax、cleaved caspase-3表达升高,Bcl-2表达降低(P<0.05)(图2,3,表4)。

Arrows indtcated apoptosis.

表4 各组大鼠肺组织细胞凋亡比较

2.5 右美托咪定对各组大鼠RhoA/ROCK信号通路的影响

与对照组相比,VILI组大鼠RhoA、ROCK、α-SMA表达升高(P<0.05);与VILI组相比,DEX-L组、DEX-H组大鼠RhoA、ROCK、α-SMA表达依次降低P<0.05);与DEX-H组大鼠相比,DEX-H+LPA组大鼠RhoA、ROCK、α-SMA表达升高(P<0.05)(图4)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with VILI group; △P<0.05 compared with DEX-L group;▲P<0.05 compared with DEX-H group.

3 讨论

VILI主要表现为肺泡-毛细血管屏障功能障碍,由于促炎因子大量释放,导致炎性反应发生,水肿明显[9]。右美托咪定作为一种新型肾上腺素能α2受体激动剂,广泛应用于麻醉,具有镇静、镇痛、抗感染、抗炎性反应抗凋亡等作用。其可以降低炎性反应,从而减轻大鼠的急性肺损伤[10]。本文研究显示,右美托咪定可以减少肺组织炎性细胞浸润,减少肺泡壁厚度,从而减轻肺损伤。

炎性反应在VILI的发生发展中至关重要,而TNF-α、IL-1β、IL-6作为重要的促炎因子细胞参与炎性反应及免疫应答,其水平高低可以用于判断肺损伤严重程度。而肺组织W/D的变化可反映肺间质水肿改变的程度。目前已知TNF-α、IL-1β、IL-6参与肺损伤,降低其水平可以减轻炎性反应,改善肺损伤,保护大鼠VILI的肺脏[11]。另外VILI的发生可以诱导细胞凋亡显著增加,从而破坏机体平衡。Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3参与细胞凋亡进程。其中下调Bax,上调Bcl-2,可以减少细胞凋亡,从而可减轻大鼠VILI[12]。本文研究显示右美托咪定可以降低VILI大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、W/D、Bax、cleaved caspase-3表达水平,升高Bcl-2表达水平,提示右美托咪定可抑制炎性反应,减少细胞凋亡,改善肺损伤。

RhoA/ROCK信号通路参与细胞的各种生理和病理过程, 尤其在炎性反应和细胞凋亡过程中发挥重要作用。Rho蛋白是一种具有GTP酶活性的小分子鸟苷酸结合蛋白,RhoA是Rho家族成员之一,在哺乳动物的各种组织中广泛表达[13]。活化的RhoA可以激活其下游靶蛋白ROCK,抑制胞质内肌动蛋白磷酸酶活性,促进α-SMA表达,进而影响细胞炎性及凋亡。研究显示,抑制Rho/Rock信号通路,可降低肺组织内炎性反应,减少细胞凋亡,从而减轻肺损伤[14]。右美托咪定可以通过抑制 信号通路,提高Bcl-2/Bax比值,减少细胞凋亡[15]。本文研究显示,右美托咪定可以降低RhoA、ROCK、α-SMA表达水平,减轻炎性反应,减少细胞凋亡,保护大鼠VILI。而RhoA激活剂可部分逆转右美托咪定对大鼠肺损伤的保护作用,证实右美托咪定通过抑制RhoA/ROCK信号通路保护大鼠VILI。

综上所述,右美托咪定通过抑制RhoA/ROCK信号通路保护大鼠VILI。本文仍存在局限性,右美托咪定作用于RhoA/ROCK信号通路的机制还尚不明确,需要进一步探讨验证。