一株副干酪乳杆菌发酵生产香菇酸奶工艺研究及挥发性成分分析

2024-03-25 08:12罗小叶田春燕刘婉琳邱树毅
中国调味品 2024年1期
关键词:挥发性成分工艺研究

罗小叶 田春燕 刘婉琳 邱树毅

摘要:為将酸奶与香菇的营养集于一体,提高酸奶的营养价值,增加香菇深加工产品的种类及酸奶的口味,该研究以香菇汁与牛奶为主要原料,接种分离筛选出的专利微生物副干酪乳杆菌进行发酵,对原料配比、加糖量、接种量、发酵温度进行单因素实验,在单因素实验结果的基础上进行响应面优化实验,确定副干酪乳杆菌发酵香菇酸奶的最佳工艺。结果表明,牛奶与香菇汁的最佳配比为2∶1,加糖量为7%,发酵剂接种量为4%,发酵温度为28 ℃,在此工艺条件下发酵制得的香菇酸奶色泽呈均匀的乳白色,具有自然的香菇和酸奶发酵风味,感官评分达81分。对其理化及微生物指标进行检测,结果表明利用该微生物及发酵工艺制得的产品符合发酵乳国家标准,同时采用顶空固相微萃取法结合气相色谱-质谱联用技术(HP-SPME/GC-MS)对其挥发性成分进行测定分析,共检测出酮类、酸类、醇类、烯烃类、烷烃类等26种挥发性风味成分,其中酮类物质相对含量最高,占57.18%,酸类物质相对含量占13.69%,同时检测到香菇主要挥发性化合物1-辛烯-3-醇(蘑菇醇)、1,2,3,5,6-五硫杂环庚烷(蘑菇精),相对含量分别为9.17%、1.96%,与感官评定香菇酸奶具有浓郁香菇风味相符合。

关键词:副干酪乳杆菌;香菇酸奶;工艺研究;响应面分析;挥发性成分

中图分类号:TS252.54文献标志码:A 文章编号:1000-9973(2024)01-0040-08

Study on Fermentation Process of Mushroom Yogurt by a Strain of Lactobacillus paracasei and Analysis of Volatile Components

LUO Xiao-ye1,2,3, TIAN Chun-yan 1,2, LIU Wan-lin1,2, QIU Shu-yi1,2*

Abstract: In order to integrate the nutrition of yogurt with that of mushrooms, improve the nutritional value of yogurt, and increase the types of deeply processed products of mushrooms and the taste of yogurt, in this study, with mushroom juice and milk as the main raw materials, the patented microorganism Lactobacillus paracasei separated and screened is inoculated for fermentation. Single factor experiment is conducted on the ratio of raw materials, sugar addition amount, inoculation amount and fermentation temperature. Based on the results of single factor experiment, response surface optimization experiment  is used to determine the optimal process for the fermentation of mushroom yogurt by Lactobacillus paracasei. The  results show that the optimal ratio of milk to mushroom juice is 2∶1, the addition amount of sugar is 7%, the starter inoculation amount is 4% and the fermentation temperature is 28 ℃. Under these conditions,the  obtained mushroom yogurt has uniform milky white color, with the flavor of natural mushrooms and yogurt fermentation.  The sensory score reaches 81 points. The physical, chemical and microbiological indexes are detected, and the results show that the products produced using this microorganism and fermentation process meet the national standards for fermented milk.At the same time, the volatile components are determined and analyzed using headspace solid-phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry (HP-SPME/GC-MS). A total of 26 volatile flavor components, including ketones, acids, alcohols, olefins and alkanes are detected, among which, the relative content of ketones is the highest, accounting for 57.18%, and the relative content of acids accounts for 13.69%. Meanwhile, the main volatile compounds of mushrooms, such as 1-octen-3-ol (mushroom alcohol) and 1,2,3,5,6-pentathiepane (mushroom essence) are detected, and the relative content accounts for 9.17% and 1.96% respectively, which is consistent with the sensory evaluation that mushroom yogurt has a strong mushroom flavor.

Key words: Lactobacillus paracasei; mushroom yogurt; process research; response surface analysis; volatile components

随着人们对饮食健康越来越重视,香菇所具有的各种营养和保健功能无疑是香菇作为保健食品的基础[1]。香菇不仅有独特的香气,而且味道鲜美,蛋白含量高,脂肪含量低,所以广受消费者喜爱[2]。香菇除了含有蛋白、脂肪,还含有香菇多糖、嘌呤、酪氨酸等,研究表明香菇多糖可以促进T淋巴细胞的产生并提高其杀伤活力,从而具有提高人体免疫力的功能[3]。香菇酸奶的研发不仅可以集合香菇与酸奶的营养价值,提高产品价值,而且为香菇深加工提供了有效的方法。副干酪乳杆菌是干酪乳杆菌的一个亚种,为革兰氏阳性菌,无孢子,同型发酵,常见于健康人体肠道[4]、自然发酵乳制品及其他发酵产品中,具有很强的耐盐、耐酸性,其菌落呈灰白色的不透明圆形,菌落较小,表面及边缘整齐光滑,其在发酵过程中,微生物产生的部分代谢产物对人体有益,如乙酸等有机酸类物质具有降低胃肠道酸度的作用,细菌素等肽类物质具有抑制肠道致病菌活性等作用[5]。目前香菇酸奶的制作大多以发酵效能较成熟的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌作为发酵剂进行酸奶发酵[6],且发酵温度较高,而对用副干酪乳杆菌单菌种常温发酵香菇酸奶的方法研究较少。本实验用的植物乳杆菌是从贵州传统发酵食品酸汤中分离筛选的,食用安全性有保障,其发酵性能较好,产酸能力较强,能耐受pH 4.0的环境。本研究在挖掘传统发酵食品功能微生物资源的同时,将功能微生物应用于其他发酵食品领域,通过研究香菇酸奶将香菇和酸奶的营养集于一体[7],在提高产品营养价值的同时也为我国香菇深加工产品和乳制品新产品的开发提供了新途径。

1 材料和方法

1.1 实验材料和仪器

1.1.1 供试原料

香菇:由贵州安庆菌农业科技有限公司提供;副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei):由贵州白酸汤分离筛选得到,该微生物在实验室编号为FBKL1.3028,且在中国典型培养物保藏中心保藏,编号为CCTCC NO:M2020156。

1.1.2 实验仪器

立式压力蒸汽灭菌锅、生化培养箱、PHS-3C酸度计、全自动凯氏定氮仪、脂肪测定仪、HP6890/5975C GC/MS联用仪;其他常用仪器由重点实验室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺路线

香菇酸奶制备工艺路线及流程:鲜香菇洗净→切碎→榨汁→煮沸→过滤→香菇汁→加入纯牛奶调配均匀→巴氏灭菌→冷却→接种发酵剂→发酵→冷藏后熟→成品检测。

1.2.2 检测方法

1.2.2.1 感官评价

参照GB 19302—2010《食品安全国家标准 发酵乳》及RHB 104-2020《发酵乳感官评鉴细则》对产品进行量化感官评价,评价标准见表1。

1.2.2.2 理化指标的测定

脂肪的测定:参考GB 5009.6—2016中脂肪的测定方法;蛋白质的测定:参考GB 5009.5—2016中蛋白质的测定方法;酸度的测定:参考GB 5009.239—2016中酸度的测定方法;pH的测定:用PHS-3C酸度计进行测定。

1.2.2.3 微生物指標的检测

乳酸菌数:参考GB 4789.35—2016中乳酸菌的检测方法;大肠菌群:参考GB 4789.3—2016中大肠菌群的计数方法;沙门氏菌:参考GB 4789.4—2016中沙门氏菌的检测方法;金黄色葡萄球菌:参考GB 4789.10—2010中金黄色葡萄球菌的检测方法;霉菌、酵母菌:参考GB 4789.15—2016中霉菌和酵母菌的检测方法。

1.2.3 单因素实验

香菇酸奶是将香菇汁、牛奶、葡萄糖混合,经微生物发酵而成,牛奶与香菇汁的配比、加糖量、发酵剂接种量及发酵温度对香菇酸奶的品质都有影响。通过单因素实验确定牛奶与香菇汁的配比、加糖量、发酵剂接种量及发酵温度的最佳条件。

1.2.4 响应面实验

通过单因素实验,以3个影响较大的因素(加糖量、发酵剂接种量和发酵温度)作为考察因素,采用Box-Behnken响应面优化模型,优化香菇酸奶的制作工艺[8],响应面实验因素与水平见表2。

1.2.5 挥发性成分的测定

1.2.5.1 检测方法

样品处理方法:将发酵结束经冷藏后熟的香菇酸奶样品混匀后称取10 g,置于25 mL顶空瓶中,在60 ℃磁力搅拌加热顶空萃取60 min后热解吸5 min。

色谱条件:色谱柱为Agilent HP-5MS弹性石英毛细管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),初始温度40 ℃,保持2 min后以3.5 ℃/min升温至180 ℃,再以10 ℃/min升温至310 ℃,保持60 min;载气为高纯He(99.999%),汽化室温度250 ℃,柱前压15.79 psi,载气流速1.0 mL/min,分流比10∶1,溶剂延迟时间3 min。

质谱条件:离子源为EI源;离子源温度230 ℃;四极杆温度150 ℃;电子能量70 eV;发射电流34.6 μA;倍增器电压1 776 V;接口温度280 ℃;质量扫描范围(m/z)29~500 amu[9]。

1.2.5.2 数据处理

所有数据均进行3次重复实验。采用Excel 2010对实验数据进行统计,Origin 2018和TBtools用于对特征风味成分进行主成分分析和聚类分析及图形的绘制。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果分析

2.1.1 牛奶与香菇汁的配比对产品质量的影响

在发酵剂接种量4%、葡萄糖添加量7%及发酵温度28 ℃的条件下,研究以牛奶∶香菇汁为1∶1、1∶2、2∶1、3∶1以及空白对照(不添加香菇汁)为单因素进行发酵实验,根据表1规定的有关标准对产品进行感官评分,确定最佳配比,实验结果见表3。

由表3可知,牛奶与香菇汁的配比为2∶1时,总体风味及组织状态最佳,在色泽、气味及滋味方面都优于其他配比,总体可接受度最高。焦镭等[10]对香菇酸奶工艺研究中适宜的牛奶与香菇汁配比为2∶1,本实验结果与其研究结果相近。

2.1.2 加糖量对产品质量的影响

在牛奶与香菇汁的配比为2∶1、发酵剂接种量为4%、发酵温度为28 ℃的条件下,以加糖量5%、6%、7%、8%、9%为单因素进行发酵实验,根据表1规定的有关标准对产品进行感官评分,确定最佳加糖量,实验结果见表4。

由表4可知,在加糖量为7%时滋味较好,酸甜比例适中,口感细腻,总体可接受度最佳,与焦镭等[10]、黄聪亮等[11]、李飞等[12]、孙立梅等[13]对香菇酸奶研究中加糖量一致,且添加的均为蔗糖。此外,马俪珍等[14]、贺晓龙等[15]、郑坚强等[7]对香菇酸奶研究中加糖量为8%,糖添加量不同与在发酵过程中使用不同产地原料香菇的营养成分有关。

2.1.3 发酵剂接种量对产品质量的影响

在牛奶与香菇汁配比为2∶1、加糖量为7%、发酵温度为28 ℃的条件下,以发酵剂接种量2%、3%、4%、5%、6%为单因素进行发酵实验,根据表1规定的有关标准对产品进行感官评分,确定最佳发酵剂接种量,实验结果见表5[16]。

由表5可知,当发酵剂接种量为4%时,香菇酸奶具有发酵乳的独特气味,且无其他异味,在允许范围内有少量水分析出,组织状态爽滑细腻,酸甜度适中,总体更易让人接受。该实验结果与焦镭等[10]的研究结果一致,在本研究中使用的发酵剂为副干酪乳杆菌,目前酸奶发酵剂主要是嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌等组成的复合发酵剂,使用副干酪乳杆菌作为单一发酵剂发酵香菇酸奶属于首次研究。

2.1.4 发酵温度对产品质量的影响

在牛奶与香菇汁的配比为2∶1、加糖量为7%、发酵剂接种量为4%的条件下,以发酵温度24,26,28,30,32 ℃为单因素进行发酵实验,根据表1規定的有关标准对产品进行感官评分,实验结果见表6。

由表6可知,当发酵温度为28 ℃时,在气味、滋味、组织状态方面都较协调,总体可接受度最佳。由于大部分酸奶发酵均使用嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌等组成的复合发酵剂[17-18],该类菌株适宜生长温度约在40~45 ℃,而本实验从传统酸汤中分离筛选得到的功能性菌株副干酪乳杆菌生长温度范围为24~35 ℃,由于微生物特性不同,利用其发酵香菇酸奶的发酵温度与前人的研究结果也有所差异。

2.2 Box-Behnken 响应面法优化

2.2.1 响应面实验结果分析

以3个影响因素(加糖量、发酵剂接种量和发酵温度)作为考察因素,采用Box-Behnken模型,优化香菇酸奶的制作工艺。根据表1规定的有关标准对各实验号进行打分,结果见表7。

通过Design Expert 8.0.6软件进行回归拟合,以感官评分作为响应值[19],结果见表8。

得到3个自变量的二次多元实验模型,其多元回归方程式为Y=25.28-0.850A-0.431B-1.603C+0.028AB+0.018AC-0.006BC+0.019A2+0.051B2+0.027C2。由表8方差分析数据可知,二次多元模型的P<0.01,说明该实验拟合的模型具有显著性。失拟项的P=0.076 5>0.05,即失拟项不显著,其他因素对实验结果的干扰较小,残差由随机误差引起,说明Box-Behnken模型能够相对充分地反映各因素与感官评分之间的关系[20]。另外,综合评分回归方程的相关系数R2=0.920 1>0.9,说明该模型能够分析和预测香菇酸奶的发酵工艺。通过方程的一次项系数可以得出,因素C有极显著影响(P<0.01),因素A有显著影响(P<0.05);影响香菇酸奶综合评分的因素顺序为发酵温度(C)>加糖量(A)>发酵剂接种量(B)[21]。

根据 Box-Behnken 实验结果绘制香菇酸奶发酵因素等高线图及响应曲面,见图1。对回归模型进行预测分析,得出香菇酸奶的发酵工艺为发酵温度27.849 ℃、加糖量6.757%、发酵剂接种量4.106%。

2.2.2 验证实验

考虑到实际实验和生产的可行性,将各因素参数调整为发酵温度28 ℃、加糖量7%、发酵剂接种量4%。依据确定的最佳提取工艺进行验证(实验号n=3),实际测得香菇酸奶的最终感官评分为81分,与理论值80.432分相比无显著性差异,说明优选的香菇酸奶发酵工艺合理可行。

2.3 感官指标分析

对以实验条件牛奶与香菇汁的配比2∶1、发酵温度28 ℃、加糖量7%、发酵剂接种量4%所制得的香菇酸奶的感官指标进行检测。色泽、滋味和组织状态均符合GB 19302—2010《食品安全国家标准 发酵乳》中有关规定,最终根据表1所规定的标准进行感官评价,结果见图2。

由图2可知,经过响应面优化得出的香菇酸奶发酵工艺制得的香菇酸奶总体可接受度高,其在气味上有香菇味、奶香味,酸味柔和均匀;外观上其色泽均匀一致,呈均匀乳白色,且表面光滑,无裂纹,只有较少量乳清析出;口感细腻,酸甜适中,具有香菇酸奶的滋味,酸甜味和奶香味比例适当[22];组织状态细腻柔软。

2.4 理化指标分析

经上述方法测定较优工艺条件下发酵产品理化指标,结果见表9。经对比,脂肪、蛋白质及酸度均高于国家标准,符合国标GB 19302—2010《食品安全国家标准 发酵乳》中有关规定。

2.5 微生物安全指标分析

与GB 19302—2010《食品安全国家标准 发酵乳》相比,在香菇酸奶的微生物检测中,大肠菌群的测定结果显示其大肠菌群数量低于最高安全限量值,香菇酸奶中未检出大肠杆菌;要求不得检出沙门氏菌,香菇酸奶中未检出沙门氏菌;要求不得检出金黄色葡萄球菌,香菇酸奶中未检出金黄色葡萄球菌;要求霉菌和酵母菌的含量少甚至不含有霉菌和酵母菌,香菇酸奶中未检出霉菌和酵母菌;乳酸菌数量为8×107 CFU/g,大于国家规定标准[23]。综上,利用该株副干酪乳杆菌生产出的香菇酸奶产品微生物限量及乳酸菌数量符合发酵乳规定,产品的安全性得到保障。对发酵产品微生物指标进行检测,结果见表10。

2.6 挥发性成分分析

由表11可知,第7组香菇酸奶为较优的发酵组,本实验采用HP-SPME/GC-MS技术对较优工艺生产的香菇酸奶进行挥发性成分测定及分析。

不同发酵参数条件下挥发性成分见图3。

由图3可知,发酵后的香菇酸奶的挥发性成分主要有酮类、酸类、醇类、烷烃类、烯烃类等,1~7组香菇酸奶分别检测出27,23,24,27,22,23,23种挥发性成分,发酵剂接种量、加糖量、发酵温度不同,导致挥发性成分及其含量出现差异,主要发生变化的是酸类、烷烃类和酮类物质,酮类物质在7个发酵组中含量均超过50%。第1组主要的挥发性成分是酮类(60.947%)、醇类(10.598%)、酸类(10.167%),第2组主要的挥发性成分是酮类(66.177%)、酸类(15.167%)、醇类(11.344%),第3组主要的挥发性成分是酮类(63.867%)、醇类(11.322%),第4组主要的挥发性成分是酮类(57.900%)、酸类(13.690%)、醇类(11.980%),第5组主要的挥发性成分是酮类(62.759%)、醇类(10.222%),第6组主要的挥发性成分是酮类(65.736%)、醇类(11.043%),第7组主要的挥发性成分是酮类(66.783%)、醇类(12.430%)。

采用峰面积归一化法计算各挥发性成分的相对质量分数,得出29种挥发性成分的相对含量,用TBtools软件对不同参数下香菇酸奶挥发性成分进行热图聚类分析,可直接反映不同发酵组间的物质差异[24],见图4。

由图4可知,不同参数的发酵组可聚为3类,1组和4组为一类,2组、5组和6组为一类,3组和7组为一类,1组和4组的发酵温度都为28 ℃,2组、5组和6组的加糖量都为7%,3组和7组的发酵剂接种量都为4%;1组和4组的乙偶姻、2-十一酮、苯甲酸、3-亚甲基庚烷-2-乙基-1-己烯含量较高,2组、5组和6组的甲苯、2,3-丁二酮含量较高,乙醇、十六烷含量较低,3组和7组的丙酮、2-戊酮含量较高,乙酸、邻伞花烃含量较低;说明不同的因素参数比例对不同组香菇酸奶的风味具有一定的影响。

由图3和图4可知,酮类物质在香菇酸奶中占比最大,在香菇酸奶中检出8种酮类物质,分别为丙酮、2-丁酮、2,3-丁二酮、2-戊酮、3-辛酮、2-壬酮、2-十一酮、2-庚酮,其中2-庚酮的相对含量最高,第2组的2-庚酮相对含量最高,达43.738%,其次是2-壬酮,第1组和第2组的2-壬酮相对含量最高,分别为16.220%和14.344%[25]。酮类物质主要由不饱和脂肪酸的热降解以及氧化或微生物代谢产生,赋予了酸奶独特的风味[26],2-庚酮呈香蕉味、桃子味,2-壬酮呈奶油味、水果味[27],对酸奶的风味起重要作用,对酸奶的奶香味和果香味具有较大贡献。醇类化合物比较柔和,使酸奶的口感更加清爽[28],醇类物质中1-辛烯-3-醇的相对含量最高,第2组中醇类物质相对含量为11.344%,其中1-辛烯-3-醇的相对含量为9.769%,在7组中的相对含量最高,1-辛烯-3-醇又称蘑菇醇,有强烈、别致的青香、甜的药草味,常作为香料用于饮料、糖果、冰制食品、烘烤食品、调味品中[29],1-辛烯-3-醇是香菇酸奶特有的风味物质。酸类化合物主要是微生物分解代谢糖类以及氨基酸的产物,是酸奶的主要风味物质之一,主要体现在口感上[30],在香菇酸奶中检出的3种酸分别为乙酸、辛酸和苯甲酸,第2组的酸类物质相对含量较其他组高,为15.167%,且乙酸、辛酸和苯甲酸的相对含量分别为4.986%、5.481%、4.700%。鲜香菇的挥发性物质主要是含硫化合物和八碳化合物,1-辛烯-3-醇是香菇最具代表性的八碳化合物,又称蘑菇醇;1,2,3,5,6-五硫雜环庚烷又称香菇精,是一种挥发性环状含硫化合物,是香菇香味的主要呈味成分之一,香味强烈并且特征性强[31]。利用副干酪乳杆菌在优选发酵工艺条件下生产的香菇酸奶中检测到蘑菇醇和香菇精,发酵的香菇酸奶香菇风味浓郁,与感官评定结果相符合。

2.7 香菇酸奶挥发性主成分分析

对不同发酵参数的香菇酸奶的挥发性物质进行主成分分析,结果见图5。每个点代表一个样品组,点与点的距离表示样品组之间特征值差异的大小,同一象限的点越接近表示挥发性成分组成及含量越相似[32-33]。

由图5可知,PC1(41.1%)和PC2(25.0%)累计方差贡献率为66.1%,能够反映不同发酵参数的香菇酸奶挥发性成分的大部分信息,在不同参数条件下香菇酸奶样品组分布在4个象限内,说明样品差异显著,第3组、第6组、第7组分布在二维坐标图中第一象限内,决定这一结果的主要挥发性物质是酮类和烯烃类;第2组分布在二维坐标图中第二象限内,决定这一结果的主要挥发性物质是醇类、酮类、酸类;第4组分布在二维坐标图中第三象限内,决定这一结果的主要挥发性物质是酸类;第5组和第1组分布在二维坐标图中第四象限内,决定这一结果的主要挥发性物质是烷烃类以及其他类物质。

3 结论与展望

利用从传统发酵食品酸汤中分离出来的一株专利微生物副干酪乳杆菌发酵生产香菇酸奶产品的生产工艺是可行的,通过单因素实验结合响应面优化实验,最终确定香菇酸奶的最佳发酵工艺为牛奶与香菇汁配比2∶1、加糖量7%、副干酪乳杆菌接种量4%、发酵温度28 ℃。在此工艺条件下发酵制得的香菇酸奶色泽呈均匀乳白色,具有自然的发酵风味和气味;对其理化及微生物安全指标的检测表明利用该微生物发酵的香菇酸奶产品符合有关国家标准;采用HP-SPME/GC-MS技术对香菇酸奶挥发性成分进行测定分析,共检测出酮类、酸类、醇类、烯烃类、烷烃类等26种挥发性风味成分,其中酮类物质相对含量最高,占57.18%,酸类物质相对含量占13.69%,同时检测到香菇主要挥发性化合物1-辛烯-3-醇(蘑菇醇)、1,2,3,5,6-五硫杂环庚烷(蘑菇精),相对含量分别占9.17%、1.96%,與感官评定香菇酸奶具有浓郁香菇风味相符合。该研究对传统发酵食品中微生物资源挖掘与利用有一定理论意义,此外,在后期研究中在产品稳定性、副干酪乳杆菌发酵代谢产生的风味成分、功能性因子及利用该微生物制成成熟直投式发酵菌剂等方面可进一步研究探讨,以期提高复合功能性酸奶食品的应用价值。

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收稿日期:2023-07-02

基金项目:黔教合KY字[2022]147号;黔科合成果[2020]2Y043;黔科合支撑[2021]一般106;黔科合支撑[2021]一般133;国家自然科学基金(32060518);黔人领发[2018]3 号

作者简介:罗小叶(1991—),女,实验师,博士研究生,研究方向:发酵食品及微生物应用。

*通信作者:邱树毅(1963—),男,教授,博士,研究方向:發酵工程、食品生物技术。

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