微小RNA-15a表达与妊娠期糖尿病患者胎儿心脏畸形的关系分析

王 彦,周 淑,于 萍,余 建,张瑞琪

(1.四川大学华西第二医院 中国出生缺陷监测中心,四川 成都,610000;2.四川锦欣妇女儿童医院 产科,四川 成都,610000)

妊娠期糖尿病(GDM)是妊娠期间常见并发症,全球GDM的发生率为2%～38%[1]。GDM患者母体血糖升高可导致胎儿血糖升高,容易诱发子代心脏发育异常,从而导致胎儿心脏畸形,严重危害胎儿和母体健康,加重家庭和社会经济负担[2]。临床采用孕期超声筛查胎儿心脏畸形,但因胎儿心脏病理解剖相对复杂,搏动速度过快,导致超声检查容易出现漏诊和误诊现象,且超声检查主要是用于诊断已发生的胎儿心脏畸形,无法提前筛选出存在高风险的胎儿[3]。因此,寻找可靠有效的生物标志物,及早发现高风险胎儿并采取预防手段,对降低新生儿出生缺陷,提高出生人口质量具有重要意义。微小RNA(miRNA)在各种疾病的病理生理过程中均发挥重要作用。研究[4]报道miRNA与GDM的发病机制有关,并可作为诊断新生儿出生缺陷的生物标志物。研究[5]发现miR-15a过表达可参与调控心脏纤维化的发生发展,可作为诊断心肌纤维化的生物标志物和治疗靶点。血清miR-15a异常高表达与2型糖尿病的疾病进展密切相关[6]。但miR-15a在GDM患者血清中的表达情况及其与胎儿心脏畸形的关系尚鲜有文献报道。本研究通过探讨GDM患者血清miR-15a表达与胎儿心脏畸形的关系,旨在为临床早期防治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入标准:① 疾病组均符合GDM相关诊断标准[7],空腹血糖≥5.1 mmol/L,若空腹血糖在4.4～5.1 mmol/L,则行75 g口服葡萄糖耐量试验; ②健康组均经孕检确诊身体健康; ③ 均为自然受孕、单胎妊娠者; ③ 确诊孕周≥24周者; ④ 均意向在本院进行后续产检、生产者; ⑤ 均签署知情同意书者。

排除标准:① 孕早期发现胎儿心脏畸形流产者; ② 孕期接触过药物、辐射、宠物、装修、酒精、吸烟等致畸因素者; ③ 既往存在胎儿畸形者; ④ 合并其他妊娠期疾病者; ⑤ 严重心、肝、肾等功能障碍者,精神认知障碍者; ⑥ 合并恶性肿瘤者; ⑦ 子宫畸形、胎位异常、产道异常、宫内感染者; ⑧ 血液、免疫系统疾病者; ⑨ 孕期有呼吸道感染疾病史患者; ⑩ 甲状腺、肾上腺疾病者。

脱落标准:① 依从性差者; ② 主动退出者; ③ 失访者; ④ 对于引产或死产的胎儿家属不同意进行尸体解剖者。

1.2 方法

血清miR-15a的检测方法:疾病组于治疗前、健康组于体检当天均采集清晨空腹静脉血5 mL,置于无菌抗凝管,4 000转/min离心10 min分离血清,取上清液置于-80 ℃冰箱中保存待测。采用TRIzol裂解法提取总RNA,并检测RNA的浓度和纯度(紫外分光光度计法)。根据逆转录试剂盒进行逆转录。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)进行PCR扩增,PCR扩增条件:96 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s、66 ℃ 30 s,71 ℃ 30 s,共40个循环,为减少误差每个反应均重复3次以上,采用2-△△Ct方法计算miR-15a表达。miR-15a引物序列:正向引物5′-TAGCAGCACATAATGGTTTGTG-3′,反向引物5′-GCCTCTAACATTGACAGC-3′; 内参U6正向引物5′-CCATGCTCTTCTACTCCT-3′,反向引物5′-CACTGATGTCGGTTAGTT-3′。

所有患者均进行跟踪随访至妊娠结束,其中针对引产或死产的胎儿,经家属同意后进行尸体解剖,以确诊胎儿心脏畸形; 持续妊娠者,在胎儿娩出后,通过超声检查和实验室检查明确心脏情况。根据GDM患者是否发生胎儿心脏畸形将其分为畸形组和非畸形组。

收集患者的一般资料,包括年龄、确诊孕周、孕前体质量指数、文化程度、不良孕产史(不明原因的自然流产、胚胎停育、产后大出血、难产、死胎和死产)、产妇类型、血糖控制情况(空腹血糖≤5.3 mmol/L、餐后2 h血糖≤6.7 mmol/L记为血糖控制良好,空腹血糖>5.3 mmol/L、餐后2 h血糖>6.7 mmol/L记为血糖控制不良)、妊娠早期是否规律服用叶酸和钙铁等。另根据确诊孕周不同,将疾病组患者分为A组(565例,确诊孕周≤32周)和B组(270例,确诊孕周>32周)[8]; 根据空腹血糖升高程度将血糖控制不良的190例患者分为C组(105例,空腹血糖5.3～6.1 mmol/L)和D组(85例,空腹血糖≥6.1 mmol/L)[9]。

1.3 观察指标

比较疾病组和健康组血清miR-15a表达水平; 统计胎儿心脏畸形的发生情况,并比较畸形组和非畸形组血清miR-15a表达水平及一般资料。比较不同确诊孕周患者血清miR-15a表达水平与胎儿心脏畸形发生率。比较不同空腹血糖升高程度患者血清miR-15a表达水平与胎儿心脏畸形发生率。分析GDM患者发生胎儿心脏畸形的影响因素。分析血清miR-15a表达水平对GDM患者胎儿心脏畸形的预测价值。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 疾病组和健康组血清miR-15a表达

疾病组血清miR-15a表达水平为(2.07±0.48),高于健康组的1.00,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 畸形组和非畸形组血清miR-15a表达及一般资料比较

835例GDM患者中发生胎儿心脏畸形24例,发生率为2.87%(24/835)。畸形组和非畸形组确诊孕周、文化程度、产妇类型、妊娠早期规律服用钙铁比较,差异无统计学意义(P>0.05); 畸形组血清miR-15a表达水平、年龄、孕前体质量指数和不良孕产史、血糖控制不良占比均高于非畸形组,妊娠早期规律服用叶酸占比低于非畸形组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 畸形组和非畸形组血清miR-15a表达及一般资料比较

2.3 A组和B组的血清miR-15a表达与胎儿心脏畸形发生率比较

A组、B组的血清miR-15a表达及胎儿心脏畸形发生率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 A组和B组血清miR-15a表达与胎儿心脏畸形发生率比较

2.4 C组和D组血清miR-15a表达与胎儿心脏畸形发生率比较

D组的血清miR-15a表达水平、胎儿心脏畸形发生率高于C组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 C组和D组血清miR-15a表达与胎儿心脏畸形发生率比较

2.5 GDM患者胎儿心脏畸形的多因素分析

将上述表2中有统计学差异的临床资料进行赋值,年龄(实测值)、孕前体质量指数(实测值)、不良孕产史(有=1,无=0)、血糖控制情况(良好=0,不良=1)、妊娠早期规律服用叶酸(有=0,无=1)、血清miR-15a表达(实测值)作为自变量,以胎儿心脏畸形作为因变量(发生=1,未发生=0)。进行多因素Logistic回归分析法(逐步向前法)结果显示,血清miR-15a表达、年龄、血糖控制不佳均是GDM患者胎儿心脏畸形的影响因素(P<0.05)。见表4。

表4 影响GDM患者胎儿心脏畸形的多因素分析

2.6 血清miR-15a表达对GDM患者胎儿心脏畸形的预测价值

ROC曲线分析结果显示,血清miR-15a表达预测GDM患者胎儿心脏畸形的Cut-off值、灵敏度、特异度、AUC分别为2.34、87.50%、73.24%、0.827(95%CI:0.799～0.852)。见图1。

图1 血清miR-15a表达对GDM患者胎儿心脏畸形的预测ROC曲线

3 讨 论

GDM是导致子代畸形的常见母体疾病,胎儿心脏畸形是子代畸形中比较常见的一种先天性畸形疾病[10]。近年来,随着人们生活水平提高和饮食结构的改变,GDM发病率呈逐年上升趋势,胎儿心脏畸形的发生率也明显增加,其已经成为导致死胎和婴儿死亡的主要原因[11]。本研究结果显示,835例GDM患者中发生胎儿心脏畸形24例,总发生率为2.87%,稍高于张亮等[12]报道的2.17%,这可能与选取样本的个体差异性有关,但均证实了GDM患者胎儿心脏畸形的发生率较高。因此,积极探寻GDM患者胎儿心脏畸形影响因素,对指导临床制定干预对策,预防胎儿心脏畸形、降低新生儿死亡率具有重要意义。

本研究结果显示,疾病组血清miR-15a表达高于健康组,提示血清miR-15a表达可能与GDM的发生发展密切相关。miRNA可通过抑制或降解调控基因表达,参与细胞增殖、分化、死亡、糖脂代谢等多种生物学过程,与GDM的发病机制和胰岛素抵抗之间存紧密联系。miR-15a表达在糖尿病患者血浆中异常升高,且与病情严重程度相关,其在胰岛β细胞分泌胰岛素的过程中起到重要作用[13]。研究[14]报道,GDM患者血清miR-15a表达高于健康孕妇,本研究报道与之相符。研究[15]发现,GDM患者骨骼肌中miR-15a过表达能够改变胰岛素信号通路蛋白表达,从而影响胰岛素分泌。由此可见,miR-15a表达可能参与了GDM的发生发展。本研究结果显示,畸形组血清miR-15a表达高于非畸形组,且经多因素Logistic回归分析法分析显示,血清miR-15a高表达是GDM患者胎儿心脏畸形的影响因素,提示血清miR-15a表达与GDM患者胎儿心脏畸形的发生密切相关。miRNA参与胚胎心脏的发育过程,在心脏形态形成、心肌细胞生长分化的过程中有至关重要的作用。研究[16]发现,胎儿脐带血中的miRNA可作为先天性心脏病产前筛查工具。miR-15a过表达可通过诱导氧化应激,影响心肌细胞的增殖与分化,导致心肌纤维肥大、增生、排列紊乱,血管内皮生成和心脏发育规律异常,进一步导致法洛四联症、室间隔缺损等胎儿心脏异常情况出现。研究[17]发现,下调miR-15a能够激活2型糖尿病心脏中的纤维化信号,这可能成为治疗或预防2型糖尿病诱导的心脏纤维化重塑的潜在靶点。另有研究[18]指出,通过抑制miR-15a-5p表达可抑制细胞凋亡,从而达到保护心肌的目的。因此,GDM患者血清miR-15a异常高表达时,可能影响胎儿心脏发育,导致胎儿心脏畸形发生。本研究结果发现,D组血清miR-15a表达与胎儿心脏畸形发生率均高于C组,说明空腹血糖水平升高程度越高,患者病情越严重,血清miR-15a表达越高,胎儿心脏畸形发生率也就越高。同时本研究还发现,不同确诊孕周患者血清miR-15a表达与胎儿心脏畸形发生率均基本一致,这可能是因为中晚期孕妇更加注重自身和胎儿身体健康,严格按时体检,能够及时发现GDM并给予控制血糖水平,从而降低胎儿心脏畸形发生率。

本研究通过ROC曲线进一步分析显示,血清miR-15a表达预测GDM患者胎儿心脏畸形的灵敏度、特异度、AUC分别为87.50%、73.24%、0.827,表明血清miR-15a表达对GDM患者胎儿心脏畸形具有一定的预测价值。故建议GDM患者定期检测血清miR-15a表达,以指导临床及时采取措施干预,降低胎儿心脏畸形的发生风险。本研究结果发现,年龄、血糖控制不良是GDM患者胎儿心脏畸形的影响因素。高龄GDM患者卵巢功能和卵巢质量下降,影响卵巢细胞正常分裂,染色体异常概率增加,容易增加胎儿心脏畸形的发生风险。研究[19]报道,年龄≥35岁是胎儿先天性心脏病的高危因素。血糖控制不良的GDM患者高血糖水平能够通过胎盘破坏卵黄囊的发育,影响胚胎的增殖分化,导致胎儿心脏氧化应激损伤或生长发育异常,从而增加胎儿心脏畸形的发生率。既往研究[20]报道,GDM孕妇血糖控制情况与胎儿畸形发生率有关。此外,本研究结果显示,畸形组孕前体质量指数、不良孕产史虽均高于非畸形组,妊娠早期规律服用叶酸虽低于非畸形组,但上述因素均并非胎儿心脏畸形的危险因素,与既往研究报道[21]不一致,原因可能是:近年来随着人们生活水平和医疗保健水平提高,孕产妇及其家属孕期健康认知水平也逐渐增强,产前检查、孕期积极锻炼、规律服用叶酸等的依从性均显著增强,且GDM患者存在个体差异,均可影响研究结果。本研究存在一定的不足之处:首先,血清miR-15a表达与GDM患者胎儿心脏畸形的具体发病机制尚为完全阐明; 其次,如何利用该指标指导临床治疗方案的制定也有待商榷。今后可在此基础上进行更深入的探讨。

综上所述,GDM患者血清miR-15a异常高表达,其表达升高可增加胎儿心脏畸形的发生风险,且对GDM患者胎儿心脏畸形具有一定的预测价值。年龄、血糖控制不佳是GDM患者胎儿心脏畸形的影响因素,建议临床根据以上因素进行早期预防,以降低GDM患者胎儿心脏畸形的发生风险。miR-15a表达在GDM患者血清中异常升高,在胎儿心脏畸形患者血清中表达更高,且与GDM患者胎儿心脏畸形的发生密切相关,并对该不良事件具有一定预测价值,可帮助临床早期筛查胎儿心脏畸形,为临床治疗提供重要指导。