基于快速型心律失常大鼠模型优选白喉乌头炮制品*

崔梦茹，赵翡翠，聂继红，张海英，赵生俊△

（1. 新疆医科大学第四临床医学院，新疆乌鲁木齐 830000； 2. 新疆医科大学附属中医医院，新疆乌鲁木齐 830000； 3. 新疆中药炮制研究重点实验室，新疆乌鲁木齐 830000）

快速型心律失常可导致心排血量骤减甚至出现循环中断，继而发生重要器官缺血缺氧，临床表现为心源性休克、心绞痛。其中，持续性室性快型性心律失常和心房颤动（简称房颤）伴快速心室率可导致血流动力学恶化，需紧急治疗［1］。目前，临床常用的抗心律失常药物有钠离子通道阻滞剂、β 肾上腺素能受体阻滞剂、延长动作电位间期药物和钙离子通道阻滞剂。多数抗心律失常药物有致心律失常、损害心功能及心外脏器的副作用［2］。药用植物中存在许多具有显著药理活性的天然成分，在抑制心律失常方面具有独特优势［3］。白喉乌头收载于《哈萨克药志》［4］等文献，为毛茛科乌头属的多年生草本植物，主要分布于甘肃、新疆及东北地区。该药材根部供药用，其性大热，味辛、苦，有毒，有祛风散寒、消肿止痛、通经活络之功，多用于风寒湿痹等疾病的治疗。白喉乌头主要成分高乌甲素还具有抗炎、镇痛、抗心律失常、抗肿瘤等作用［5-7］。高乌甲素及其水解产物刺乌宁在相应的有效剂量范围内，室性期前收缩（又称室性早搏）潜伏期、室性心动过速（简称室速）发生率、心律失常完全抑制率等与其呈剂量相关性［8-9］。白喉乌头生品毒性较大，可通过炮制降低毒性，其中以药典法和哈萨克族炮制法炮制品的毒性较小，前期研究表明，哈萨克族炮制法对白喉乌头具有较好的减毒增效作用［10-11］。为此，本研究中基于快速型心律失常大鼠模型优选白喉乌头哈萨克族炮制法炮制品。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪器：BL-420S型生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）；FA2004N 型精密电子天平（上海菁海仪器有限公司，精度0.1 mg）；xMarkTM型酶标仪（美国Bio-Rad公司）；E200型生物显微镜（日本Nikon公司）。

试药：乌头碱对照品（成都曼思特科技有限公司，批号为A0196，含量≥98%）；注射用胺碘酮（法国Sanofi - Aventis 公司，批号为DA019）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、肌酸激酶同工酶MB（CK -MB）、心肌肌钙蛋白I（cTnI）酶联免疫吸附试验（ELISA）及三磷酸腺苷（ATP）酶检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为A001-3-2，A003-1-2，A016-2-2，H197，H197）；免疫组化染色孵育盒（福州迈新生物技术开发有限公司，批号为BOX-1001）。白喉乌头，采自新疆伊犁哈萨克自治州尼勒克县，经新疆医科大学附属中医医院李永和主任中药师鉴定为正品。

动物：Wistar 大鼠96 只，4～6 周龄，雌雄各半，体质量（180±20）g，购自新疆医科大学动物实验中心，实验动物生产许可证号SCXK（新）2018-0002，实验动物使用许可证号SYXK（新）2018 - 0003。饲养环境温度（23±3）℃，相对湿度40%～70%。

1.2 方法

1.2.1 药液制备

白喉乌头炮制品：采用哈萨克族炮制法炮制。分别称取500 g 白喉乌头生品8 份，分为2 组；第1 组每份加10倍量水浸泡24 h后，加入8%甘草和10%黑豆与其共同煎煮1，2，3，4 h，分别命名为24 h - 1 h 组、24 h -2 h 组、24 h-3 h 组、24 h-4 h 组。第2 组每份仅浸泡时间缩短为12 h，其余条件不变，分别命名为12 h-1 h组、12 h-2 h 组、12 h-3 h 组、12 h-4 h 组。煎煮完成后取出切片，晾干，烘箱烘干备用。

白喉乌头炮制品药液：取白喉乌头生品及8种炮制品各200 g，加8 倍量水浸泡0.5 h，加热煮沸30 min，4层纱布重合平铺过滤，滤渣加8倍量水煎煮，重复2次，合并3 次滤液，制成水煎液-95%乙醇（2.5∶1，V/V）成品，置4 ℃下80 h，2 000 r/min 离心12 min，取上清液，置65 ℃恒温水浴锅内，浓缩成300%的药液。

1.2.2 建模、分组及给药

将96 只大鼠随机分为空白对照组（等体积生理盐水），模型组（等体积生理盐水），白喉乌头生品药物组（简称生药组，0.4 g/kg），白喉乌头炮制品8 个组（1.2 g/kg，分别记为12 h-1 h 组、12 h-2 h 组、12 h-3 h组、12 h-4 h组、24 h-1 h组、24 h-2 h组、24 h-3 h组、24 h - 4 h 组），胺碘酮组（5 mg/kg），各8 只。各组大鼠每天1次灌胃相应药物或生理盐水，连续14 d后空白对照组大鼠尾静脉注射等体积生理盐水，其余各组大鼠均注射10 mg/mL乌头碱（3.125 mg/kg）以复制快速型心律失常模型。

1.2.3 观察指标

心电图（ECG）：末次给药1 h 后，麻醉，仰卧固定大鼠，皮下插针，以生物信号采集系统记录大鼠Ⅱ导联ECG，先记录稳定5 min 的ECG，动态记录大鼠ECG 20～30 min，记录大鼠心律失常［早搏、室速、心室颤动（室颤）］的持续时间，以及大鼠死亡时间（如未死亡，仅记录为“未死亡”）。

心脏组织病理形态：取大鼠心脏组织，用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切5 μm厚片，用二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水后，苏木素-伊红（HE）复染，中性树胶封片，显微镜下观察。

血清学指标：取大鼠腹主动脉血，4 ℃下，3 000 r/min离心15 min，收集上清液，采用ELISA 法检测大鼠血清中的SOD，MDA，CK-MB，cTnI的水平。

心脏组织ATP酶：取大鼠心脏组织适量，匀浆，检测Na+，K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶的活性。

心脏组织Cx45 蛋白表达：取“心脏组织病理形态”项下二甲苯脱蜡成品，梯度乙醇水化，抗原修复，去除内源性过氧化物酶，孵育（一抗、二抗分别稀释1 000倍、2 000倍），染色，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 ECG

模型组大鼠均出现早搏、室颤、室速症状。12 h-1 h组、12 h-2 h 组、12 h-3 h 组、12 h-4 h 组、24 h-2 h 组、24 h - 3 h 组、24 h - 4 h 组、胺碘酮组大鼠均仅出现早搏及室速症状，但平均出现时间均显著晚于模型组（P＜0.01）；24 h-1 h 组大鼠未出现室颤、室速和早搏症状。详见表1。

表1 各组大鼠早搏、室速、室颤出现时间比较Tab.1 Comparison of the occurrence time of premature beats，ventricular tachycardia and ventricular fibrillation in each group

2.2 血清学指标

与空白对照组比较，模型组大鼠的血清SOD 水平显著降低，MDA，cTnI，CK - MB 水平均显著升高；与模型组比较，生药组、炮制品8个组、胺碘酮组大鼠的血清SOD水平均显著升高，生药组、12 h-1 h组、12 h-2 h组、24 h-1 h组大鼠的血清MDA水平均显著降低（P＜0.05），各给药组（除24 h-2 h 组、24 h-3 h 组外）cTnI 水平均显著降低（P＜0.05），各给药组（除24 h - 3 h 组外）大鼠血清CK-MB水平均显著降低（P＜0.05）。详见表2。

表2 各组大鼠血清学指标比较（±s，n=6）Tab.2 Comparison of serological indicators in each group（X ± s，n = 6）

表2 各组大鼠血清学指标比较（±s，n=6）Tab.2 Comparison of serological indicators in each group（X ± s，n = 6）

注：与空白对照组比较，#P ＜0.05。表3同。Note：Compared with those in the blank control group，#P ＜0.05（for Tab.2 - 3）.

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2.3 心脏组织ATP 酶

与空白对照组比较，模型组大鼠心脏组织的Na+，K+-ATP 酶及Ca2+-ATP 酶、Mg2+-ATP 酶活性均显著减弱（P＜0.05）。与模型组比较，24 h-2 h 组、24 h-3 h 组、胺碘酮组大鼠心脏组织的Ca2+-ATP 酶活性均显著增强（P＜0.05）。详见表3。

表3 各组大鼠心脏组织ATP酶活性比较［±s，µmol/（mg·h），n=6］Tab.3 Comparison of ATPase activity in cardiac tissue in each group［X ± s，µmol /（mg·h），n = 6］

表3 各组大鼠心脏组织ATP酶活性比较［±s，µmol/（mg·h），n=6］Tab.3 Comparison of ATPase activity in cardiac tissue in each group［X ± s，µmol /（mg·h），n = 6］

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2.4 心脏组织病理形态

空白对照组大鼠的心肌纤维排列规则，心肌细胞形态正常，可见横纹，细胞核、细胞质染色均匀，间质紧密，未见明显异常。模型组大鼠的心肌纤维排列紊乱，部分纤维断裂，消失，心肌细胞形态不规则，可见较多核固缩，细胞质红染，间质疏松，出血，可见炎性细胞散在或灶状浸润。与模型组比较，生药组大鼠的心肌细胞水肿，空泡变性，坏死区域增大，浸润炎性细胞数量增多，间质疏松程度增加；炮制品8 个组大鼠的心肌纤维排列紊乱程度降低，心肌细胞水肿、损伤程度降低，损伤范围缩小，浸润炎性细胞数量未明显减少。详见图1。

A. 空白对照组 B. 模型组 C. 胺碘酮组 D. 生药组 E - L. 炮制品8个组图1 大鼠心脏组织病理形态（HE，×400）A.Blank control group B.Model group C.Amiodarone group D.Raw drug group E - L.Eight processed product groupsFig.1 Pathological morphology of cardiac tissue in rats（HE，× 400）

2.5 Cx45 蛋白表达

与空白对照组比较，模型组大鼠的Cx45 蛋白表达水平显著降低；与模型组比较，胺碘酮组、炮制品8个组大鼠的Cx45 蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）；生药组大鼠的Cx45 蛋白表达水平稍升高，但无显著差异（P＞0.05）。详见图2。

3 讨论

乌头碱所诱导的心律失常动物模型是经典的药理学建模方法［12］，乌头碱激活心肌细胞Na+通道，使Na+内流增加，从而影响心肌细胞线粒体功能、细胞膜离子通道、缝隙连接及诱导细胞凋亡和氧化损伤等，诱发心律失常（如早搏、室速、室颤）。SOD 的主要功能是催化超氧阴离子的歧化反应，被看作活性氧防御的第一线；MDA 是过氧化脂质的一种重要的分解产物，两者用作评价脂质过氧化程度。心肌缺血后SOD 活性减弱，而MDA 含量增加，细胞受氧自由基攻击的程度加重，且清除超氧阴离子的能力减弱，导致心肌细胞受损加剧。CK-MB 主要位于心肌组织中，心肌坏死后被释放入外周血中，而cTnI 是心肌细胞死亡最敏感和最特异的标志物，两者均作为心肌损伤的标志性诊断指标。本研究结果表明，白喉乌头炮制品对乌头碱所致心肌损伤有一定修复能力，并可提高心脏组织抗氧化损伤的能力。

心肌细胞几乎全部依赖有氧代谢产生的ATP以供细胞生存及做功的需要，ATP的产生和储存均在线粒体中进行，线粒体中ATP 酶的活性在维持心肌细胞及胞内钙镁的稳态方面可发挥重要作用。心肌缺血缺氧时，线粒体中Mg2+含量减少，而Na+和Ca2+含量增多，可能引起能量代谢障碍，使依赖于ATP 的Na+，K+-ATP 酶及Ca2+，Mg2+-ATP 酶活性减弱，致使心肌能量代谢出现障碍［13-14］。本研究结果表明，白喉乌头炮制品对乌头碱所致心肌细胞能量代谢障碍有一定修复能力，可促进能量代谢。

HE 染色主要用于观察细胞内部的形态结构；显微镜下大体可观察到心肌纤维的排列、心肌细胞的形态及细胞核、细胞质染色是否均匀，间质是否紧密；借此可判定心肌损伤的程度。本研究结果可知，生药组小鼠的心肌细胞水肿，空泡变性，坏死区域增大，表明生药对心肌细胞毒性较大；炮制品8个组大鼠的心肌纤维排列紊乱程度降低，心肌细胞水肿、损伤程度降低，损伤范围减小，表明白喉乌头经炮制后毒性降低，对乌头碱所致心肌细胞损害有一定防护作用。

缝隙连接（GJ）是由连接相邻2 个细胞之间的连接通道排列而成的一种特殊膜结构，构成缝隙连接的基本单位是连接蛋白Cx。研究显示，在成年人心脏组织中Cx43 含量最丰富，主要存在于工作心肌细胞内。Cx40 及Cx45 含量较少，Cx40 主要分布于心房及近端传导系，Cx45 分布于整个传导系统，是窦房结和房室结缝隙连接的主要成分。可见，心脏不同部位Cx 的表达和分布情况与其电传导功能密切相关［15］。显微镜下观察Cx45 的表达，可对比心肌损伤程度的差异［16］。本研究结果表明，白喉乌头炮制品可修复乌头碱所致心肌损伤。

综上所述，哈萨克族炮制法制成的白喉乌头炮制品对模型大鼠快速型心律失常均有一定预防作用，其中以24 h-1 h炮制品效果较显著。