氟维司群注射液前处理及细菌内毒素检查方法研究*

洪 颖，翁鹭娜，林丽花，盖雅婷

（福建省厦门市食品药品质量检验研究院，福建厦门 361000）

乳腺癌为女性最常见的恶性肿瘤，68%～78%的患者表达雌激素受体（ER）和/ 或孕激素受体（PR）［1］。氟维司群属雌激素受体拮抗剂［2］，其通过直接与ER 结合来抵消雌激素的作用［3］，对Luminal 亚型的疗效确切，可直接用于导管内注射，给药频率相对较低，从而提高了患者的治疗依从性［4］。鲎试剂与内毒素的反应多在水中进行，氟维司群为油注射液，在水中不溶，不宜直接作为样品进行细菌内毒素检查。鉴于氟维司群注射液尚未被各国药典收载，本研究中采用加水萃取的前处理方法，考察水相干扰试验、加水萃取过程中油溶液的内毒素回收比，采用凝胶法、动态显色法、动态浊度法等检查细菌内毒素，为该产品的细菌内毒素检查提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

BET-48G 型细菌内毒素测定仪（天津天大天发科技有限公司）；Research plus 型微量移液器（德国Eppendorf公司，移液范围50～1 000 μL）；M3 basic 型涡旋混合器（德国IKA公司）；3-15 Operating Manual型高速离心机（美国Sigma公司）。

1.2 试药

氟维司群注射液（某公司，共3 批，批号分别以A，B，C 指代，规格为每支5 mL∶250 mg）；细菌内毒素工作标准品（CSE，湛江安度斯生物有限公司，批号为2205050，规格为每支10 EU）；鲎试剂1，2（TAL1，TAL2，湛江安度斯生物有限公司，批号分别为2203160，2202230，灵敏度分别为0.125 EU/ mL 和0.005～50 EU/ mL）；鲎试剂3（TAL3，福州新北生化工业有限公司，批号为21101012，灵敏度为0.125 EU/ mL）；鲎试剂4（TAL4，厦门鲎试剂生物科技股份有限公司，批号为22034102，灵敏度为0.005～10 EU/ mL）；细菌内毒素检查用水（BET用水，湛江安度斯生物有限公司、福州新北生化工业有限公司，批号分别为2105260，21070105，规格均为每支5 mL）。

2 方法与结果

2.1 细菌内毒素限值（L）的确定

计算公式为L=K/M。其中，K为人每千克体质量每小时最大可接受内毒素剂量，M为人用每千克体质量每小时的最大供试品剂量。根据药品说明书，本品的每日最大剂量为500 mg，按第43 版美国药典（2020 年），M= 500 mg / 1.8 m2= 277.78 mg / m2，L=K/M=100（EU·m2）/ 277.78（mg/ m2）= 0.36 EU/ mg；按2020 年版《中国药典（四部）》通则1143（以下简称通则1143）［5］，K= 5 EU/（kg·h），体质量按60 kg 计算，注射时间＜1 h（按1 h计），计算得M=8.33 mg/（kg·h），L=0.60 EU/mg。从严要求，将L定为0.36 EU/mg。

测定样品中的内毒素，需将其与水充分涡旋混匀后，测定水相中内毒素的含量。水萃取条件：取氟维司群注射液0.5 mL，加BET 用水5 mL，2 000 r/ min 振荡5 min，3 000 r/min 离心5 min，取上层水相溶液进行检测。水相溶液的内毒素限值（Lc）与氟维司群注射液的内毒素限值（L）存在以下关系：Lc水×V水=L油×V油×内毒素回收比（%），假设回收比为100%，则Lc水=L油×V油/V水=1.8 EU/mL。

2.2 凝胶法试验

2.2.1 灵敏度复核

依据通则1143 对所用鲎试剂进行复核，结果TAL1与TAL3的灵敏度（λc）分别为λ和1.68λ，在0.5λ～2λ范围内，符合规定。

2.2.2 水相干扰试验

干扰试验预试验：内毒素检查时的最大有效稀释倍数（MVD）=cL/λ，c为供试品溶液体积分数（1.0 mL/mL），λ为市售鲎试剂的标示灵敏度（通常为0.03～0.5EU/mL），则水相对应的MVD为3.6，7.2，14.4，28.8，57.6 倍。取3 批样品，按2.1 项下方法水萃取后用BET 用水稀释至2，4，8，16 倍系列溶液，记为供试品阴性对照（NPC）。同时制备相同稀释倍数含0.25 EU/mL内毒素系列溶液，记为供试品阳性对照（PPC）。取TAL1 与TAL3，分别与上述NPC 和PPC 系列溶液反应，每一浓度平行2 支，同时做阳性对照（PC）和阴性对照（NC）。结果显示，水相稀释至2倍及以上对鲎试剂无干扰，可以该浓度进行正式干扰试验。详见表1（+为阳性反应，-为阴性反应；表2同）。

表1 氟维司群凝胶法水相干扰预试验结果Tab.1 Results of interference pre - test of aqueous phase for fulvestrant by gel - clot method

表2 氟维司群凝胶法水相干扰正式试验结果Tab.2 Results of interference test of aqueous phase for fulvestrant by gel - clot method

正式干扰试验：取3 批样品0.5 mL，按2.1 项下方法水萃取后，取水相，用BET用水倍比稀释至2倍，加入CSE，制备含0.25，0.125，0.06，0.03 EU/mL 内毒素的供试品溶液，每一浓度平行4 支，同时做内毒素标准品系列溶液和NC，每一浓度平行做2 支。结果见表2。可见，水相稀释至2倍对鲎试剂无干扰，即水相可稀释至2倍进行内毒素检查。

2.2.3 油相中内毒素回收比试验

取CSE 3 支，分别加入3 批样品各0.5 mL，涡旋混匀，按2.1 项下方法水萃取得水相，加BET 用水稀释得8 倍、16 倍、32 倍、64 倍系列浓度，进行内毒素含量检测，每一浓度平行4 支。加入CSE 的样品溶液浓度为20 EU/mL，萃取入水相后水相中内毒素含量为2 EU/mL，即16λ。取CSE 1支，加BET用水配制至2 EU/mL，再进行8 倍（0.25 EU/ mL）、16 倍（0.125 EU/ mL）、32 倍（0.06 EU/mL）和64 倍（0.03 EU/mL）系列稀释，每一浓度平行2 支，另做NC。结果表明，标准品溶液系列结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求，各批次水相8 倍稀释（理论值0.25 EU/mL）下与鲎试剂反应均为阳性，64 倍稀释（理论值0.03 EU/mL）下与鲎试剂反应均为阴性，内毒素回收比范围在50%～200%，符合要求。详见表3。

表3 氟维司群凝胶法油相中内毒素回收比试验结果Tab.3 Results of endotoxin recovery - ratio test in oily phase for fulvestrant by gel - clot method

2.2.4 凝胶限度试验

按通则1143 用TAL1 对3 批样品进行细菌内毒素检查，按2.1 项下方法水萃取后，取水相加BET 用水稀释2 倍后进行检查，NPC 结果均为阴性，PPC 结果均为阳性，结果表明3 批样品细菌内毒素检验结果均符合规定。

2.3 动态显色法试验

2.3.1 标准曲线可靠性试验

按通则1143，制备浓度分别为2.0，0.5，0.125，0.031 25 EU/ mL 的内毒素标准品溶液，各取0.1 mL，分别加入预先添加0.1 mL 鲎试剂（TAL2）的试管中，混匀，检测，每个浓度平行3 支，另做2 支NC。工作波长405 nm，预设吸光度0.05，结果见表4。以反应时间（t）的对数（lg）值为横坐标、溶液中内毒素浓度（C）的lg 值为纵坐标进行线性回归，得回归方程lgt1=2.493 55-0.389 09 lgC1（r= - 1.000）。|r| ＞0.98，NC 反应时间大于标准曲线最低点的反应时间，表明标准曲线可靠性试验有效。

表4 动态显色法标准曲线可靠性试验结果（n=3）Tab.4 Results of reliability test of standard curve by kinetic chromogenic assay（n = 3）

2.3.2 水相干扰试验

取3 批样品，按2.1 项下方法水萃取，水相用BET用水稀释至2倍、4倍、8倍、16倍系列溶液，记为a液，同时制备同样稀释倍数的含0.5 EU/mL内毒素的系列溶液，记为b液，进行回收试验，分别取上述溶液各0.1 mL，加入预先添加0.1 mL鲎试剂的试管内中，混匀，每个浓度平行2支，同时做标准内毒素溶液管和NC管。测定结束后，按标准曲线回归方程分别计算a 液和b 液的细菌内毒素含量，回收比按公式回收比=（Cb液-Ca液）/0.5×100%计算。结果见表5（其中a 液各溶液结果均小于检测限，但仪器仍会有实测值，并根据实测值计算回收比）。表明各批次水相溶液的各稀释倍数回收比均在50%～200%范围内，即水相在稀释至2 倍及以上时对鲎试剂无干扰。

表5 动态显色法水相干扰试验结果（n=2）Tab.5 Results of interference test of aqueous phase by kinetic chromogenic assay（n = 2）

2.3.3 油相中内毒素回收比试验

预添加CSE 的样品制备同2.2.3 项下方法，按前法进行水萃取。取水相，加BET 用水稀释至8 倍、16 倍、32 倍、64 倍系列浓度，进行内毒素含量检测，每个浓度平行2 支。水相中内毒素含量理论值为2 EU/mL，原液内毒素含量= 实测值× 稀释倍数，绝对回收比= 原液内毒素含量/（2 EU/mL）×100%。结果见表6。可见，样品外加内毒素20 EU/mL经振荡萃取后，用显色法检测内毒素回收比在65.04%～98.02%范围内，均符合要求（在50%～200%范围内）。随着稀释倍数的增大，绝对回收比有下降趋势。

表6 动态显色法油相中内毒素回收比试验结果（n=2）Tab.6 Results of endotoxin recovery - ratio test in oily phase by kinetic chromogenic assay（n = 2）

2.4 动态浊度法试验

2.4.1 标准曲线可靠性试验

按2.3.1 项下方法制备系列浓度的内毒素标准品溶液，各取0.1 mL，分别加入预先添加0.1 mL 鲎试剂（TAL4）的试管中，混匀，检测，每个浓度平行3 支，另做2支NC。工作条件同2.3.1项，结果见表7。以lgt为横坐标、lgC为纵坐标进行线性回归，得回归方程lgt2=2.501 16 - 0.373 4 lgC2（r= - 0.997），表明标准曲线可靠性试验有效。

表7 动态浊度法标准曲线可靠性试验结果（n=3）Tab.7 Results of reliability test of standard curve by kinetic turbidimetric assay（n = 3）

2.4.2 水相干扰试验

试验方法同2.3.2 项下，结果见表8。可见，各批次水相溶液的各稀释倍数回收比均在50%～200%范围内，表明水相稀释至2倍及以上时对鲎试剂无干扰。

表8 动态浊度法水相干扰试验结果（n=2）Tab.8 Results of interference test of aqueous phase by kinetic turbidimetric assay（n = 2）

2.4.3 油相中内毒素回收比试验

试验方法同2.3.3 项下，结果见表9。可见，样品外加内毒素20 EU/mL经振荡萃取后，用动态浊度法检测内毒素绝对回收比在62.52%～113.64%范围内，均符合要求（在50%～200%范围内）。

表9 动态浊度法油相中内毒素回收比试验结果（n=2）Tab.9 Results of endotoxin recovery - ratio test in oily phase by kinetic turbidimetric assay（n = 2）

3 讨论

细菌内毒素与鲎试剂的系列酶促反应需在水中进行［6］，如待测样品水溶性差，则需进行前处理后再进行检测［7-9］。氟维司群注射剂为油注射剂，如直接用水稀释进行后续反应，存在稀释浓度不准确、内毒素被油包裹释放不完全等问题，很可能导致检测结果不准确。因此，找到该类制剂合适的前处理方法是进行细菌内毒素检查的必要前提。前期探索研究时曾参考原料药的处理方法［10］，采用二甲基亚砜、甲醇等有机溶剂溶解注射液后，再用BET 用水稀释进行检查，但出现溶剂对鲎试剂有干扰、内毒素绝对回收比无法达到要求等问题。

对于油溶液，萃取亦是常用的前处理方法，由于内毒素溶于水，首先考虑用水作为溶剂进行萃取，在进行干扰试验时，应考虑以下两点。一是萃取后的水相可见些许浑浊，提示油相中有部分辅料和药物可能溶解于水中，应验证水相溶液对鲎试剂与内毒素的凝集反应是否有干扰作用［11-12］。二是对于需前处理的样品，为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要考察萃取后油液中内毒素的绝对回收比［13］，即要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验或检测，绝对回收比应在50%～200%范围内。

凝胶法为我国目前内毒素检测的“仲裁法”，检验操作简单，在日常检验中采用较多，但凝胶法仅可定性检测内毒素含量是否超过限值，无法准确定量。动态光度测定法能得到较确切的数值，在检验、生产质量控制中应用较广泛［14］。本研究中分别采用凝胶法、动态显色法、动态浊度法等对萃取后的水相溶液进行干扰试验，确认水相溶液稀释至2倍及以上时，在各方法下对鲎试剂反应均无干扰，且油液中内毒素绝对回收比满足要求。表明本研究采用的前处理方法操作简便、水相干扰小，适用于目前常用的3种细菌内毒素检查方法，能较准确地检测氟维司群注射液中内毒素的含量。

综上所述，氟维司群注射液采用凝胶法、动态显色法、动态浊度法进行细菌内毒素检查均可行，拟订的检查方法为取样品0.5 mL，加入BET用水5 mL，2 000 r/min振荡5 min，3 000 r/min离心5 min，取水相，按2020年版《中国药典（四部）》通则1143 检查，每1 mg 氟维司群中内毒素含量应小于0.36 EU。