PFOS 及其三种替代品对蚯蚓的毒性效应及比较

李登昙,卢成波,王晓乐,杜仲坤,李 冰,王金花,王 军,张静文,朱鲁生(山东农业大学资源与环境学院,山东 泰安 271018)

作为全氟及多氟烷基化合物(PFAS)的典型代表,全氟辛烷磺酸(PFOS)因其具有良好的热稳定性、耐高温和耐化学腐蚀等独特的物理化学性质,在工业领域和日常消费品中都得到了广泛的应用[1].由于PFOS 的环境持久性、远距离迁移性和生物蓄积性等特征,其生产或使用已在全球范围内被禁止[2-4].因此,为了满足工业应用的需求并考虑到降低对环境的负面影响,人们研发和生产了大量新型PFOS 替代品.其中主要包括将碳链中的部分C-F 键替代为C-H键的6:2氟调聚磺酸(6:2FTSA)以及降低碳链长度的全氟己烷磺酸(PFHxS)和全氟丁烷磺酸(PFBS)等.由于这些替代品的结构与PFOS 结构相似,而且目前已在水体、大气、土壤和生物体等多种环境介质中广泛检测到它们的存在[5-7].因此,近年来这些替代品对环境带来的负面影响备受关注.已有研究表明6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 对水蚤[8]、斑马鱼[9-10]和小鼠[11]等多种生物具有潜在的毒性效应,甚至在某些方面这些替代品对生物体表现出比PFOS 更高的毒性效应.然而6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 对土壤无脊椎动物,特别是对蚯蚓的毒性效应尚不清楚.此外,与PFOS 相比,它们对蚯蚓的综合毒性是否降低也仍未知.

本文以赤子爱胜蚓(E. fetida)为受试生物,从氧化应激、生殖毒性和发育毒性3 个方面研究了PFOS及其3 种典型替代品6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 以相同浓度(0.2mg/kg)暴露28d(OECD)后对蚯蚓的毒性效应;并通过计算综合生物标志物响应(IBR)指数综合评估了PFOS 与其替代品的毒性大小和差异.

1 材料与方法

1.1 实验材料

PFOS(CAS 号为2795-39-3,纯度≥98%)购自上海安谱实验科技股份有限公司;6:2FTSA(CAS 号为27619-97-2,纯度≥98%)购自上海麦克林生化科技股份有限公司;PFHxS(CAS 号为3871-99-6,纯度≥98%)和PFBS(CAS 号为29420-49-3,纯度≥98%)购自北京百灵威科技有限公司.4 种PFAS 的结构式如图1 所示.E. fetida(0.3～0.6g)购自河北省鑫伊达蚯蚓养殖场,在光照培养箱(光暗比为16h:8h,光照强度为650lx,湿度为80%,温度为20°C)中预培养2 周以上.研究中所使用的其它化学品均为分析纯.

图1 PFOS、6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 结构式Fig.1 The structural formulas of PFOS, 6:2FTSA, PFHxS,and PFBS

本研究采用经济合作与发展组织(OECD)[12]规定的人工土壤(由石英砂、高岭土和泥炭藓组成,配比为7:2:1, pH 值为6.0 左右,含水率为35%).试验开始前,将E. fetida 放于该土壤中继续预培养24h.

1.2 暴露实验

染毒浓度采用PFAS 的环境相关浓度(0.2mg/kg)[13-16].以水为溶剂制备PFAS 溶液(0.3mg/mL).每个暴露组(3个平行)共含1500g人工土.首先称取50g人工土加入1mL 0.3mg/mL 的PFAS 溶液混合均匀,然后再加入1450g 人工土充分搅拌混匀,最后按照OECD 规定加入去离子水(525g)将土壤含水率调节至35%,分装至3 个1L 烧杯中.对照土壤(CK)为只含35%去离子水的人工土壤.

按照OECD 的规定,每个烧杯放置10 条蚯蚓,并记录烧杯总重量,在光照培养箱(与预培养条件相同)中培养28d.通过称重监测土壤含水量的变化,每7d 补充一次水分.

1.3 指标测定

在暴露后的第28d,从每个处理组的3 个烧杯中各取3 条蚯蚓,即每个处理组共9 条.3 条用于测定活性氧(ROS)含量,3 条用于测定酶活性(超氧化物歧化酶,SOD;过氧化氢酶,CAT;谷胱甘肽硫转移酶,GST)、丙二醛(MDA)和8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量,3条用于测定基因相对表达水平.所有指标的测定均采用生物学平行.在测定之前,将蚯蚓从土壤中取出放在铺有滤纸的培养皿上进行冲洗并过夜吐泥.

1.3.1 ROS 含量测定 使用手持高速匀浆机对蚯蚓(已提前加入7mL 预冷的ROS 磷酸盐缓冲液)冰浴均质化后离心20min(3000g,4°C),随后取上清液继续离心20min(20000g,4°C),弃去上清后用ROS 磷酸盐缓冲液对沉淀进行重悬浮,即得到ROS 待测液.采用DCFH-DA 法测定ROS 含量[17].

1.3.2 酶活性、MDA 和8-OHdG 含量测定 使用手持高速匀浆机对整条蚯蚓(已提前加入蚯蚓体重10 倍的SOD 磷酸盐缓冲液)冰浴均质化后离心10min(10000r/min,4°C),所得上清液即为待测液.分别采用氮蓝四唑法[18]、紫外吸收法[19]、1-氯-2,4-二硝基苯比色法[20]和硫代巴比妥酸比色法[21]测定SOD、CAT、GST 活性以及MDA 含量. 8-OHdG 含量根据酶联免疫分析试剂盒(上海恒远生物科技有限公司)说明书进行测定.

1.3.3 基因相对表达水平测定 采用Trizol 法提取整条蚯蚓的总RNA.经纯化处理后,检测RNA 纯度和完整度.使用反转录试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)将合格的RNA 反转录合成cDNA(反转录反应体系如表1 所示).最后以β-actin 为内参基因,通过实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)技术对钙网蛋白(CRT)基因、热休克蛋白(HSP70)基因、产卵激素(ANN)基因和肿瘤转录控制蛋白(TCTP)基因进行相对定量检测.基因引物信息和Real-time PCR反应条件分别如表2 和表3 所示.

表1 反转录反应体系Table 1 Reaction system of reverse transcription

表2 基因引物信息Table 2 Gene primer information

表3 Real-time PCR 反应条件Table 3 Reaction conditions of Real-time PCR

1.3.4 综合毒性评估 IBR 指数整合了所有不同生物标志物的结果以了解污染物对生物体的综合影响[22].在本研究中,参照Sanchez 等[23]的方法,计算测量的所有生物标志物的偏差系数和IBR值以评价各生物标志物对PFAS 暴露后的敏感程度以及PFAS 对蚯蚓的综合毒性大小和差异.

1.4 数据处理与分析

试验结果采用 Microsoft Excel 2019 和OriginPro 2022b 进行分析处理和制图.采用SPSS 22.0 对数据进行单因素方差分析和最小显著性差异检验(P<0.05).

2 结果与分析

在整个暴露期间(28d),未观察到蚯蚓死亡或体重下降.

2.1 PFAS 对蚯蚓的氧化应激效应

2.1.1 ROS 含量变化 与CK 相比,PFOS、PFHxS和PFBS 处理均诱导蚯蚓产生过量的ROS(图2(a)).其中,PFOS 处理组中的ROS 含量显著高于PFBS,但与PFHxS 之间无显著性差异.PFHxS 处理组ROS含量略高于PFBS,但两组之间也无显著性差异.6:2FTSA 处理后也诱导ROS 含量上升,但与CK 相比并没有显著性差异.

图2 PFAS 暴露后蚯蚓体内ROS 含量和抗氧化酶活性的变化Fig.2 Changes in ROS content and antioxidant enzymes activities in earthworms after exposure to PFAS

2.1.2 抗氧化酶活性变化 与CK 相比,所有PFAS处理组均显著促进SOD 活性(图2(b)).其中PFHxS处理组与PFOS 之间无显著性差异,但显著高于6:2FTSA 和PFBS 处理组;PFOS 处理组与6:2FTSA之间没有显著性差异,但显著高于PFBS 处理组;6:2FTSA 对SOD 活性的促进作用略高于PFBS 处理组,但两者之间不具有显著性差异.

与CK 相比,PFOS 和6:2FTSA 处理组均显著抑制CAT 活性,两者之间无显著性差异;PFHxS 和PFBS处理组均显著促进CAT活性,PFHxS处理组的促进作用略高于PFBS,但两者之间无显著性差异(图2(c)).

PFOS 和PFHxS 处理组GST 活性显著高于CK组以及6:2FTSA 和PFBS 处理组,但两组之间不存在显著性差异;6:2FTSA 和PFBS 处理组对GST 活性没有显著性影响(图2(d)).

2.1.3 MDA含量变化 所有PFAS处理组的蚯蚓体内MDA 含量均显著高于CK 组(图3(a)).其中PFHxS处理组与PFOS 之间无显著性差异,但显著高于6:2FTSA 和PFBS 处理组;PFOS 处理组与6:2FTSA之间没有显著性差异,但显著高于PFBS 处理组;6:2FTSA 和PFBS 处理组之间没有显著性差异.

图3 PFAS 暴露后蚯蚓体内MDA 和8-OHdG 含量的变化Fig.3 Changes in MDA and 8-OHdG content in earthworms after exposure to PFAS

2.1.4 8-OHdG 含量变化 相比于CK 组,PFOS、6:2FTSA 和PFHxS 处理组均显著诱导8-OHdG 含量上升,但3 个处理组之间没有显著性差异;PFBS 处理组对8-OHdG 含量没有显著性影响(图3(b)).

2.1.5 HSP70 和CRT 基因表达变化 相比于CK组,PFOS、PFHxS 和PFBS 处理组中HSP70 基因相对表达水平均显著上调,但3 个处理组之间没有显著性差异;6:2FTSA 对HSP70 基因表达也具有一定的促进作用,但与CK 相比没有显著性差异(图4(a)).

图4 PFAS 暴露后蚯蚓体内HSP70 和CRT 基因表达的变化Fig.4 Changes in expression of HSP 70 and CRT genes in earthworms after exposure to PFAS

所有PFAS 处理组的蚯蚓体内CRT 基因相对表达水平均显著高于对照水平(图4(b)).其中,PFOS、6:2FTSA 和PFHxS 处理组之间没有显著性差异,但均显著高于PFBS 处理组.

2.2 PFAS 对蚯蚓ANN 基因表达的影响

与CK 组相比,所有PFAS 处理组均显著抑制蚯蚓体内ANN 基因相对表达水平(图5(a)).其中,PFOS、PFHxS 和PFBS 处理组的抑制作用强于6:2FTSA,但3 个处理组之间没有显著性差异.

图5 PFAS 暴露后蚯蚓体内ANN 和TCTP 基因表达的变化Fig.5 Changes in expression of ANN and TCTP genes in earthworms after exposure to PFAS

2.3 PFAS 对蚯蚓TCTP 基因表达的影响

相比于CK 组,所有PFAS 处理组均显著促进蚯蚓体内TCTP 基因相对表达水平(图5(b)).其中,PFOS和PFHxS处理组的促进作用最强,但两组之间不存在显著性差异;PFBS 处理组TCTP 基因相对表达水平显著高于6:2FTSA.

2.4 综合毒性评估

计算各指标的偏差系数图6,在雷达图中,多边形与每条轴线的交点表示各生物标志物的偏差系数.偏差系数大于零代表促进效应,小于零则代表抑制效应.从各指标对PFAS响应的偏差系数来看,CRT基因是对PFOS 和6:2FTSA 暴露响应程度最大的指标,而对PFHxS 和PFBS 暴露响应程度最大的指标是MDA 和HSP70 基因.

图6 PFAS 暴露后对各指标的偏差系数(雷达图)Fig.6 Deviation coefficient(radar plot) and for each indicator after exposure to PFAS

通过计算个处理组的IBR 指数可知,PFOS 处理组的 IBR 值(36.4)最大,略高于 PFHxS 处理组(34.1);PFBS处理组IBR值(24.3)低于PFHxS处理组,但要高于6:2FTSA 处理组(22.2).

3 讨论

3.1 PFAS 诱导蚯蚓氧化应激效应

ROS 是指一系列含氧化学反应物质,主要包括机体正常代谢产生的自由基活性氧(如和OH)和非自由基活性氧(如H2O2)[24].它们的产生和消除一般在生物体内各种抗氧化酶的作用下处于较为稳定的动态平衡状态.正常情况下ROS 不会对细胞造成负面影响.但当生物体暴露于污染物时,这些物质往往会参与多种氧化反应,此时,ROS 产生和消除的稳态被打破,出现ROS 的产生增加或ROS 自清洁能力下降等现象,从而造成ROS过度积累,最终导致氧化应激或细胞死亡[25].ROS 含量升高通常表明机体内氧化应激水平增加[26].在本研究中,0.2mg/kg PFOS、6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 暴露28d 后,E.fetida 体内ROS 含量明显增加.同样地,在Chen 等[27]的研究中,PFOS 和PFBS 暴露可显著诱导秀丽隐杆线虫体内ROS 含量升高.Feng 等[28]的研究也表明,PFOS 和PHFxS 可诱导小鼠卵母细胞内积累过量的ROS.这意味着PFAS 胁迫能够破坏生物体内细胞氧化还原状态的平衡,ROS 过度积累,从而引发氧化应激的增加与抗氧化防御机制的下降,并造成后续的氧化损伤,这可能是PFAS 毒性的主要机制之一.此外,研究发现,与3 种替代品相比,PFOS 处理后可诱导E. fetida 产生更多的ROS,这表明PFOS可能通过促进氧化应激的增加而加重对蚯蚓的毒性,从而表现出比6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 更高的毒性效应.

为应对ROS 诱导的这种损伤效应,E. fetida 体内包括SOD、CAT 和GST 在内的抗氧化酶能够在机体遭受外界胁迫时迅速发挥作用以清除多余的ROS 并尽可能地维持ROS 正常水平[29].其中,SOD是最先对氧化应激做出反应的酶之一,能够先催化分解为H2O2和O2,以保护细胞免受自由基的伤害.但H2O2也是一种高活性的ROS,具有造成大量细胞损伤的能力[24].此时,同样为抗氧化酶的CAT 能够通过不同的方式将H2O2和其他自由基进一步转化为无害的H2O 和O2.此外,作为谷胱甘肽(GSH)依赖性酶,GST 通过以GSH 为共轭物清除多余的ROS 或其他自由基,在抗氧化反应中发挥重要作用[30].在本研究中,PFOS、6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 暴露后均增强了E. fetida 体内的SOD 活性.Xu 等[31]在研究PFOS 对E. fetida 的毒性效应时发现,当PFOS 的暴露浓度低于40mg/kg 时,E. fetida 体内SOD 均被激活,与本研究结果类似.这表明PFAS 刺激机体产生了过量的ROS(),因此SOD 被激活以清除多余的,从而防止或减轻PFAS对E. fetida 造成的氧化损伤.PFHxS 和PFBS 暴露后还增强了CAT 活性,这可能是因为PFHxS 和PFBS 刺激机体产生了H2O2,亦或是在抗氧化的第一阶段,SOD 清除时导致了H2O2的积累,从而进一步激活CAT 以继续将H2O2转化为无害的H2O 和O2.然而PFOS 和6:2FTSA 处理后抑制了CAT 活性,这一结果与Wang 等[32]发现一致,在他们的研究中,5mg/L PFOS 暴露后可显著抑制涡虫CAT 活性.同样地,Liang 等[33]发现1 和2mg/L PFOS 暴露21d 后对大型蚤体内的CAT 活性也具有显著的抑制作用.这可能是因为机体受到胁迫后产生的ROS 或其他自由基超出了CAT 的清除能力,从而导致酶活性下降,抗氧化系统受损.此外,PFOS和PFHxS 暴露后诱导GST 活性上升,Wang 等[32]也发现PFOS 暴露7 和10d 以后,涡虫体内GST 活性显著上升.这表明GST 与SOD 和CAT 共同发挥作用,通过促进GSH 与污染物结合的方式来清除ROS,达到解毒的目的.

虽然生物体内存在的调控机制(例如抗氧化防御机制)能够应对外界环境胁迫所带来的不利影响,但随着越来越多的ROS 或其他自由基的积累,很可能会超出抗氧化系统的承受限度,从而对蛋白质、脂质和DNA 等大分子造成负面影响[30,34],最终导致脂质过氧化和DNA 损伤等现象.其中,MDA 是脂质过氧化的主要产物之一,被认为是氧化胁迫下细胞损伤的主要生物标志物[35];8-OHdG 与ROS 密切相关,能够敏感地反映DNA 氧化损伤的程度[36].在本研究中,PFOS、6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 处理后E. fetida体内MDA 含量均有所升高.在Bi 等人[37]的研究中发现,PFOS 暴露后,河蚬鳃和内脏中ROS 含量显著上升,尽管SOD 和CAT 活性上升以清除多余的ROS,但仍发现MDA 含量显著升高.这意味着生物体接触PFAS之后,体内的抗氧化系统无法抵御ROS介导的氧化应激,从而诱发机体脂质过氧化损伤.Chen 等[38]的研究也表明,PFOS 和PFBS 暴露后,虽然小鼠肠道中CAT 酶被激活以调控ROS 水平,但仍诱导了MDA 含量升高,并导致肠道氧化损伤.此外,PFAS 暴露后还诱导8-OHdG 含量显著上升,表明E. fetida 体内出现了DNA 损伤.Wielsoe 等[39]也发现,PFOS 和PFHxS 暴露会增加人体肝细胞中的ROS 水平,并导致DNA 损伤,与本文研究结果一致.

为进一步探究PFAS 诱导的氧化应激效应,本研究还评估了相关功能基因的mRNA 表达水平.当蚯蚓暴露于污染物时,HSP70 和CRT 基因都具有保护机体细胞免受氧化损伤的功能[26].在本研究中,PFOS、6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 暴露后,E. fetida体内HSP70 和CRT 基因的mRNA 表达水平均被不同程度地诱导,特别是PFOS 处理组.San-Segundo等[40]研究了不同浓度(24,48 和96mg/L)的PFOS 对非洲爪蟾胚胎发育过程中基因表达水平的影响,结果表明PFOS 能够显著诱导HSP70 基因的相对表达,这与本文的结果相似.这可能是由于PFAS 诱导机体产生了氧化应激,因此HSP70 和CRT 基因显著上调表达以缓解PFAS 对机体造成的氧化胁迫.

3.2 PFAS 抑制蚯蚓生殖行为

以往研究表明,ANN 是一种与蚯蚓繁殖行为密切相关的蛋白质,能够调节蚯蚓的产卵行为,被认为是评价蚯蚓繁殖能力的新型生物标志物[26,41].在本研究中,PFOS、6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 暴露28d 后,E. fetida 体内ANN 基因表达的mRNA水平显著被抑制.这表明PFAS 可以导致E. fetida产卵相关基因的mRNA 表达异常,从而抑制蚯蚓的产卵繁殖行为.本研究结果与Chen 等[27]的发现一致,PFOS 和PFBS 均可对秀丽隐杆线虫造成一定的生殖毒性,并且作者认为这种生殖毒性可能是由ROS 所诱导的.

3.3 PFAS 诱导蚯蚓细胞凋亡并影响生长发育过程

TCTP 是一种在真核生物中大量表达的多功能蛋白质,调节细胞生长、增殖和分化,参与调节无脊椎动物的生长发育过程[42].在本研究中,PFOS、6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 暴露后,E. fetida 体内TCTP 基因表达被明显激活.这表明PFAS 暴露会显著干扰E. fetida 细胞的生长、分化和增殖等过程,导致细胞凋亡,最终抑制蚯蚓生长并诱导发育毒性.

3.4 PFAS 对蚯蚓毒性的综合评估

在所有生物标志物中,CRT 基因是对PFOS 和6:2FTSA 毒性贡献最大的生物标志物,MDA 含量和HSP70 基因分别是对PFHxS 和PFBS 毒性贡献最大的生物标志物.这表明氧化应激是PFOS、6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 诱发蚯蚓毒性的最敏感指标.这些生物标志物的结果更具有代表性,能够更好地用于评估PFAS 对环境的潜在健康风险.

此外,根据IBR值可知,0.2mg/kg PFAS对蚯蚓的综合毒性为PFOS>PFHxS>PFBS>6:2FTSA.先前研究表明,PFAS 对生物体的毒性往往随碳链的缩短而降低[43].同样地,本研究结果表明,碳链更短的PFBS对蚯蚓的综合毒性明显小于较长碳链的PFOS 和PFHxS.Qiao 等[44]研究发现,PFOS 和PFHxS 对土壤细菌群落结构和功能的影响大于PFBS.在Liu 等[45]的研究中,PFHxS 处理后使得人间质干细胞活力下降,而PFBS 却未对细胞产生任何毒性.Xue 等[1]通过评估PFOS 和PFBS 对斜生栅藻生长、叶绿素荧光、抗氧化系统和转录组的影响发现,PFOS 可对斜生栅藻产生比PFBS 更高的毒性.此外,具有更小毒性的6:2FTSA 分子含有8 个碳,其较低的毒性可能与其官能团附近的碳原子以C-H 键的形式存在有关.相对于其他3 种PFAS,6:2FTSA 分子的能量更低,这导致了其在生物或非生物途径中更易于被降解,从而在环境介质中表现出较低的毒性效应[46].

4 结论

4.1 PFOS 与3 种替代品6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 暴露28d 后均诱导E. fetida 产生氧化应激效应,并导致脂质过氧化和DNA 损伤.

4.2 与氧化应激相关基因上调表达进一步加剧了PFAS 诱导的氧化应激和毒性.PFOS、6:2FTSA、PFHxS和PFBS 还会引发蚯蚓生殖毒性,诱导发育毒性.

4.3 PFOS、6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 的IBR 数值分别为36.4, 22.2, 34.1, 24.3. 4 种物质对蚯蚓的综合毒性大小依次为:PFOS> PFHxS>PFBS>6:2FTSA.氧化应激是PFOS、6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 诱发蚯蚓毒性的最敏感指标.