全外显子组测序技术在产前胎儿超声异常中的应用进展

乔梦茹 李奉瑾 姚欣雨 张玉萍

据报道,约2%～4%的孕妇产前超声提示胎儿异常[1],造成胎儿异常的因素中遗传因素最重要。遗传因素所致的胎儿异常出生后常表现为智力障碍、生长发育迟缓、严重者可致残疾甚至死亡,给家庭和社会带来沉重的负担。目前,对超声异常胎儿,可通过产前诊断技术最大限度的排除遗传性疾病,降低此类出生缺陷的发生。染色体核型分析是产前诊断的“金标准”,能检测染色体的非整倍体异常及5 Mb以上的染色体结构异常,为32%的超声异常胎儿明确病因[2]。拷贝数变异测序技术能检测出核型分析无法检测的微缺失和微重复,在染色体核型正常的超声异常胎儿中额外检出6%的致病性拷贝数变异[3],但仍有许多超声异常胎儿无法明确病因。随着二代测序技术的迅速发展,研究发现,全外显子组测序(whole exome sequencing,WES )能在染色体核型分析和拷贝数变异检测均未见异常时,将超声异常胎儿的诊断率提高8%～10%[4]。本文将从WES在产前胎儿超声异常中的应用、局限性及注意事项分别进行阐述。

一、WES在产前胎儿超声异常中的应用

1.多系统异常 胎儿多系统异常在表型上往往表现为较大的临床异质性,部分通过常规遗传学检测方法无法明确病因。近年来,多项研究利用WES在寻找胎儿多系统异常致病基因方面充分展现了其应用价值。Lord等[1]对143例多系统畸形胎儿行WES,诊断阳性率达15.4%(22/143),共涉及20个致病或可能致病性基因变异。Petrovski等[5]的研究发现,WES在胎儿多发畸形的诊断性遗传变异约为单发畸形的3倍(19%vs6%),同时还发现胎儿畸形数目越多,基因异常的检出率越高。同样,符芳等[6]的研究也表明,多系统异常胎儿WES的阳性检出率明显高于单系统异常(19.9%vs12.2%),证实了胎儿多系统异常与基因异常的高度相关性。因此,对染色体核型分析和拷贝数变异检测阴性的多系统异常胎儿,WES可能会为其明确致病基因,预防遗传病患儿的出生。

2.骨骼发育异常 胎儿骨骼发育异常(skeletal dysplasia,SD)是一类具有临床异质性和表型异质性的骨-软骨发育异常疾病,SD大多与调控骨骼发育的基因突变相关。张鑫悦等[7]对13例严重肢体短小的胎儿引产后行家系WES,诊断阳性率为76.9%(10/13),涉及的基因包括FGFR3、COL2A1、COL1A1等,其中FGFR3突变与SD关系最密切,FGFR3与配体成纤维细胞生长因子结合,引起受体酪氨酸激酶活化及自身磷酸化,促进细胞的增殖和分化,FGFR3突变可引起受体信号停止转导,胞内效应基因表达异常,导致软骨细胞增殖和分化障碍,最终出现各种骨骼发育畸形[8]。杨科等[9]应用WES对15例核型分析及拷贝数变异检测阴性的SD胎儿分析,诊断率为10/15,累及的基因除常见的FGFR3、COL2A1基因外,还首次发现DYNC2H1、WDR35基因与短肋胸廓发育不良高度相关,丰富了基因致病突变谱和表型谱。因此,WES可以进一步识别SD的致病基因,对明确其产前遗传学诊断有重要意义。

3.中枢神经系统畸形 胎儿中枢神经系统(central nervous system,CNS)畸形是一类由多种因素(遗传、化学物、感染等)导致的颅脑神经系统发育异常。研究表明[10],超过80%的CNS畸形儿经染色体核型分析、拷贝数变异检测技术仍未能明确病因,可能与单基因病有关。Yaron等[10]对86例拷贝数变异检测阴性的CNS畸形胎儿行WES,38例存在致病基因变异,诊断率提高了44%。Baptiste等[11]对268例CNS畸形胎儿行WES,发现37例存在致病或可能致病的基因变异,且在多发中枢神经系统异常(19%)和多系统异常(16.7%)的诊断率明显高于孤立的CNS畸形(7.2%)。因此,对于CNS畸形胎儿,特别是多发中枢神经系统畸形或合并其他系统异常时,在传统产前诊断技术无法明确病因时更应重视WES的检测。

4.先天性心脏发育畸形 胎儿先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)是最常见的结构畸形,多数CHD患儿系遗传因素所致。CHD胎儿中约16%～26%合并染色体异常,约3%～12%与基因变异有关[12-14]。研究表明NKX2.5、GATA4、TBX5是调控心脏发育的关键基因,对心脏传导系统、各腔室的形成及维持正常心功能起重要作用[15]。Prendiville等[16]的研究在CHD胎儿中发现了NKX2.5基因的38个突变位点,在宫内主要表现为房间隔缺损、室间隔缺损、法洛四联症。许耘红等[17]的研究显示,214例CHD患儿中有8例存在GATA4杂合同义突变。此外,当CHD合并肢体畸形、肾脏畸形等心外畸形时往往提示存在某些遗传综合征,如心手综合征、歌舞伎综合征、Alagille 综合征等,分别涉及TBX5、KMT2D、JAG1、NOTCH2等致病基因[18-19]。因此,WES不仅能提高CHD胎儿的诊断率,当怀疑存在某些遗传综合征时,还可将WES与传统的遗传学检测技术同时进行,尽早明确遗传学病因。

5.先天性泌尿系统发育异常 先天性泌尿系统发育异常(congenital anomalies of the kidney and urinary tract,CAKUT)约占先天性结构畸形的20%～30%[20]。拷贝数变异测序技术被认为是诊断CAKUT的一线检测技术。随着WES在产前诊断中的不断应用,多项研究应用WES在4.8%～14%的儿童CAKUT病例中发现了致病基因变异[21-23],证实了CAKUT与单基因病的相关性。Lei等[24]通过家系WES对163例CAKUT样本进行分析,诊断阳性率为12.3%(20/163),涉及26个致病或可能致病的基因变异。董敏等[25]在20例超声提示肾脏囊性病变的胎儿中发现6例多囊肾,致病基因包括PKD1、PKD2、PKHD1。PKD1、PKD2基因突变引起其编码的多囊蛋白功能缺陷,多种细胞信号通路异常导致细胞异常增殖,最终表现为多囊肾[26]。Shuster 等[27]对52例孤立性双侧肾脏回声增强胎儿行基因检测发现,15例为常染色体隐性多囊肾,7例为常染色体显性多囊肾,涉及的基因包括PKD1、PKHD1。因此,WES能提高CAKUT胎儿的致病性变异检出率,是拷贝数变异检测技术的有效补充。对于拷贝数变异检测未见明显异常的孤立性肾脏回声增强,也应动态观察胎儿肾脏发育情况,必要时需进一步行WES排除基因异常。

二、 WES在产前胎儿超声异常中应用的挑战和局限性

1.产前WES适用人群的选择 首先,WES在产前诊断中的适用人群目前仍局限于影像学发现的胎儿结构异常,而影像学医师、临床医师对胎儿结构畸形及相关遗传学知识的掌握程度都可能影响WES的纳入标准。其次,WES在不同系统胎儿结构畸形的应用价值不同,如胎儿多系统畸形、骨骼系统畸形与单基因病的发生最密切,中枢神经系统畸形、心血管畸形次之,而胸部畸形如肺囊腺瘤、隔离肺等与基因的关系极低,因此应个体化对待每一个病例。最后,对于有结构畸形或发育障碍的不良孕产史的孕妇,产前WES是遗传学诊断的一种手段,对此类孕妇,需留存先证者标本,行先证者、夫妻二人的家系WES,如无法提供先证者标本,但可提供其临床表型及病历资料,可通过WES对夫妻二人行隐性基因携带者筛查,从而推断先证者是否是由致病或可能致病基因导致的结构改变,为下次妊娠的选择提供理论依据。

2.产前表型的局限性 WES是基于表型的数据分析,产前胎儿影像学检查仅能提示有限的结构异常,且有些产前表型不具有特异性,对应的疾病谱较宽泛,目前尚缺乏统一的基因型和表型相关的产前数据库,因此确认产前基因型和表型的相关性极具挑战。随着遗传学疾病的不断发展,对初次WES检测未明确诊断的先天性结构畸形儿可行新增表型后的二次重分析,从而提高诊断阳性率。临床医师应对胎儿期临床表型进行详细记录,并追踪随访至出生后,将出生后的临床表型、产前表型及基因型进行再次对比分析,从而扩充基因型-表型产前数据库。

3.WES技术的局限性 产前WES仅针对具有临床意义的基因进行分析,对于WES发现的致病或可能致病的变异,仍需一代测序进行验证。WES本身受其测序深度和覆盖率的影响,不能覆盖非编码区的变异及全部的蛋白质编码序列,无法检测到所有类型的遗传变异,如染色体数目及结构异常、拷贝数变异、低水平嵌合体、三核苷酸重复扩增等。对于“假基因、重复区域、高度同源”的基因测序,WES检测能力有限,表观遗传相关变异也无法检出。因此,WES阴性结果尚不能除外所有的遗传性疾病。

4.产前WES的伦理学问题 产前WES虽能为部分超声异常胎儿明确基因诊断,但其引发的社会伦理学问题同样备受关注。除外严重遗传性疾病、致死性疾病,对于“非严重性遗传病”胚胎的去留问题一直存有争议。一方面,由于存在外显率及表现度的差异,即使是明确的致病性变异,其症状严重程度也有可能不同。另一方面,对于成年期发病的疾病,患者在发病前可无任何临床症状,此类胎儿是否需要终止妊娠也存有争议。因此,在进行WES检测前及检测后,临床医师应充分与孕妇及家属沟通可能存在的伦理问题,对WES检测结果的解读还应积极与多学科团队共同合作,客观公正地为孕妇及家属提供最全面的信息,在充分知情同意下由其权衡选择,必要时需启动伦理委员会共同商讨决定。

三、WES在产前胎儿超声异常中应用的注意事项

1.检测前咨询:临床医师应根据孕妇及家属的文化水平提供个体化咨询,包括告知WES检测的指征、优势和局限性及替代方案,详细告知WES检测的所有可能结果、诊断阳性率及检测后仍无法明确诊断的可能性,同时还应告知孕妇及家属可知情选择是否报告与检测目的不相关的发现等。最后由孕妇及家属自主选择并签署知情同意书。

2.检测后咨询:(1)阳性结果:临床医师需详细向孕妇及家属解释基因与疾病的相关性、疾病的遗传方式、预后情况、复发风险等,对选择继续妊娠的孕妇,可提供宫内治疗、新生儿科管理等咨询;对选择终止妊娠的孕妇,可根据具体情况提供下次妊娠咨询,如自然妊娠+产前诊断或胚胎植入前遗传学诊断技术+产前诊断。(2)临床意义未明的变异(VUS):临床医师应向患者及家属解释与表型相关的VUS,告知VUS还需结合父母样本、家系验证协助鉴定检测结果[28],VUS还可能根据数据库的更新及新增表型的出现需进行再次评估。(3)阴性结果:临床医师必须告知阴性结果仍无法完全排除胎儿患有某种遗传病的可能性,这与WES的检测范围有限、胎儿期表型未完全显现、临床数据积累不完善等有关,应告知其定期数据再分析的重要性,必要时可进一步行全基因组测序技术(whole genome sequencing,WGS)。

综上所述,WES能发现部分染色体核型分析及拷贝数变异检测均无法检测出的基因异常,在一定程度上弥补了传统产前诊断技术的不足。WES由于本身技术的局限性,仍有部分超声异常胎儿不能得到明确诊断。WGS能对包括非编码区在内的整个基因组的DNA序列进行检测,较WES覆盖的范围更广,能进一步提高遗传性疾病的检出率,但其存在测序成本高、分析周期长、数据量庞大、数据解读更困难等问题,并未在产前诊断领域得以广泛应用。但我们相信随着基因检测技术及生信分析流程的不断发展,产前基因型-表型数据库将会逐步完善,WES及WGS势必成为产前诊断胎儿遗传病的重要手段,为产前遗传咨询和生育指导提供理论依据。