同位素内标稀释超高效液相色谱-串联质谱法测定植物源性食品中的6-苄基腺嘌呤

◎ 夏宝林，扈战强，张亚清，殷晶晶，沈凌志，杨 娜，汪仕韬

（1.江阴市食品安全检测中心，江苏 江阴 214400；2.上海中侨职业技术大学，上海 201514）

6-苄基腺嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）是人工合成的细胞分裂素，分子式为C12H11N5，广泛用于植物组织的培养、果实生长及蔬菜保鲜等。过多的6-BA 会引发恶心、呕吐等现象，甚至致癌、致畸。我国法律规定在豆芽生产过程中，禁止使用6-BA。

植物源性食品中的6-BA 残留量检测常用的净化方法，主要有液液萃取[1]、固液萃取[2]、固相萃取[3]、QuEChERS 法[4]等。QuEChERS 法因操作简便、所需溶剂少、提取效率高等优点得到广泛应用。检测方法主要有酶联免疫法（ELISA）[5]、气质联用法、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法。近年，液相色谱-串联质谱法逐渐取代液相色谱法，被广泛用于复杂基质中的目标物检测。然而，6-BA受基质影响较大，采用基质匹配工作曲线才能准确定量，操作烦琐，基质效应大。当使用同位素内标进行校准，无需针对不同类别的样品制作不同的工作曲线，操作简单且定量准确，具有广泛的推广意义。

本文针对不同植物源性样品，进一步优化了QuEChERS 前处理方法，采用同位素内标进行定量，显著降低了基质效应，建立了一种快速、准确、高效的植物源性食品中6-BA 残留量的检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

（1）Acquity UPLC-XEVO TQ-S 超高效液相色谱-串联质谱仪（美国 Waters 公司）；Acquity UPLC BEH C18 色谱柱（50×2.1 mm，1.7 μm 美国 Waters 公司）；MV5 浓缩仪（莱伯泰科有限公司）；2-16K 通用高速冷冻离心机（赛多利斯科学仪器有限公司）；CP512 电子天平（瑞士梅特勒公司）。

（2）6-BA 标准物质（纯度99.2 %，德国Dr.Ehrenstorfer 公司）；6-BA-D5（纯度98.32%，北京坛墨质检科技有限公司）；乙腈、甲醇（HPLC 级，美国 Thermo Fisher Scientific 公司）；甲酸、乙酸（色谱纯，德国CNW 公司）；C18（十八烷基硅烷键合硅胶）、PSA（乙二胺-N-丙基填料）、无水硫酸镁（MgSO4）、氯化钠（NaCl）（分析纯，上海安谱公司）；绿豆芽、黄豆芽、番茄、黄瓜、菠菜、葡萄等均购自无锡江阴当地超市。

1.2 标准溶液的配制

称取6-BA-D5纯品5 mg，溶解于甲醇，并定容至10 mL，配制成质量浓度为0.5 mg·mL-1的标准储备液，于-20 ℃冰箱中保存。

准确称取6-BA 标准品10 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成质量浓度为1 mg·mL-1的标准储备液，于-20 ℃冰箱中保存。准确移取适量6-BA标准储备液，用10%甲醇-水（V/V，含0.1%甲酸）逐级稀释并配制适当浓度的标准工作液，其中内标浓度为5 ng·mL-1。

1.3 样品前处理

1.3.1 提取

准确称取5.00 g 充分均质的试样，加入50 μL 的100 ng·mL-1的内标，准确加入20 mL 乙腈，并振荡提取20 min，依次加入4 g 无水硫酸镁和2 g 氯化钠，涡旋1 min 后以4 000 r·min-1的转速离心10 min，取上清液待净化。

1.3.2 净化

将上清液转移至加有1.2 g 无水硫酸镁和250 mg PSA 的离心管中，对于颜色较深的试样需另加30 mg的GCB，涡旋1 min，放置澄清后，取5 mL 上清液于另一10 mL 塑料试管中，在45 ℃条件下氮吹至干，用10%甲醇-水（V/V，含0.1%甲酸），涡旋复溶后过0.22 μm 滤膜，供超高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.4 分析条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY BEH C18（50 ×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：A 为0.1%甲酸-水溶液（V/V），B 为乙腈；流速：0.25 mL·min-1；柱温：40 ℃；样品室温度：10 ℃；进样体积：5 μL；分析时间：5 min；梯度洗脱程序：0～0.2 min，5% B；0.2～2.0 min，5% B～80% B；2.0～2.1 min，80%B～90% B；2.1～3.0 min，90% B；3.0～3.1 min，90% B～5% B；3.1～5.0 min，5% B。

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾电离（ESI）源，正离子模式，多反应监测模式（MRM）；离子源温度：500 ℃；毛细管电压：1.0 kV；去溶剂气（高纯氮气）流速为800 L·h-1。质谱参数优化结果见表1。

表1 多反应监测离子及质谱参数表

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的优化

6-BA 的结构中含有氨基，属于碱性化合物，容易得到氢质子形成分子离子，在正离子模式下可以获得较强的信号。采用甲醇－水为流动相时，响应值低，峰形拖尾严重。将水替换为0.1%甲酸水溶液，结果出峰时间提前，响应值增强了3 倍，峰形得到了明显改善，最终选择甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相。

2.2 提取溶剂的选择

本研究考察了不同提取溶剂对目标物的提取效率，结果表明，甲醇和酸性甲醇的提取效率较差，基质干扰严重。纯乙腈作为提取溶剂时，因加入盐有助于乙腈与水的分层，其提取效率显著提高。纯乙腈的提取效率优于1%乙酸－乙腈。因此，本研究最终采用乙腈作为提取溶剂。

2.3 净化条件的优化

QuEChERS 净化常见的吸附剂主要有3 种，分别是C18、PSA、GCB。本实验主要考察3 种净化剂以及其混合物对净化效果的影响。PSA 可有效去除杂质，当使用量达250 mg 时，净化效果良好，低于250 mg 时净化不完全，大于400 mg 时，对目标物具有一定吸附，影响回收率。PSA 的使用量应在250～400 mg。C18具有一定去除色素的能力，但净化效果较差。对于颜色较深的样品，可以加入GCB，但用量不宜超过30 mg。另外，净化管中加入无水硫酸镁1.2 g，充分吸收水分，保证净化效果。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性范围、检出限、定量限

6-BA 在0.5～50 ng·mL-1的范围内线性良好，线性方程为y=0.866x+0.023，相关系数（r2）为 0.999 9。6-BA 定性离子碎片信号强度远远低于定量离子，离子比率仅为0.028。为了安全起见，本文以定性离子信噪比确定检出限，而非传统的MRM 色谱峰。取阴性基质5.00 g，加入不同质量的目标物，静置12 h 后，提取净化，并上机测定，以定性离子的信噪比（S/N）大于3 倍时确定为检出限，大于10 倍时确定为定量限，得到目标物的检出限为0.5 μg·kg-1，定量限为1.5 μg·kg-1。图1 为加标量为0.5 μg·kg-1的菠菜样品中6-BA 多反应监测结果。

图1 加标量为0.5 μg·kg-1 的菠菜样品的6-BA 多反应监测图（A 为226.2>91.1；B 为226.2>148.0）

2.4.2 准确度和精密度

取绿豆芽、黄豆芽、番茄、黄瓜、菠菜、葡萄等样品各1 份，每份样品均质后各称取6 份，每份5.0 g于50 mL 离心管内分别加入50 μL 的6-BA-D5内标使用液（1.0 μg ·mL-1)，再准确加入一定量的6-BA标准溶液，分别制备成 10、30、50 μg·kg-1的加标样品静置 12 h 后，按 1.4 样品处理操作，并重复测定6 次计算方法的准确度和精密度。不同样品中，6-BA 的回收率为89.0%～110.3%，相对标准偏差为1.55%～3.56%。

2.5 样品测定

利用所建方法对购于江阴市各大超市、农贸市场的绿豆芽、黄豆芽、西红柿、黄瓜、蘑菇、圣女果各20 份进行检测。3 份绿豆芽、2 份黄豆芽中有检出，其中，最大值为72.5 μg·kg-1，最小值为5 μg·kg-1。

3 结论

本研究建立了植物源性食品中6-BA 的测定方法，样品经乙腈提取、QuEChERS 净化、高效液相色谱-串联质谱检测，并采用同位素内标法进行定量。结果表明，该法准确、可靠、高效，能够满足国内关于6-BA 残留限量的要求。