食品微生物检验中大肠杆菌的快速检测方法研究

◎ 朱炳华

（胶州市疾控中心，山东 青岛 266300）

食品微生物检验在食品安全领域具有至关重要的作用，其中大肠杆菌的检测颇受关注。大肠杆菌作为一种常见的食源性病原体，广泛存在于人们的生活中，其可能导致肠胃不适，出现腹泻等症状，人类健康因此受到极大影响。所以，快速精确地检测食品中的大肠杆菌，显得尤为重要。

传统的食品微生物检验途径主要由培养方法与免疫学手段构成，然而，这些方式耗时较长、灵敏度不足。随着分子生物学与免疫学领域的持续突破，一些新兴的灵敏度高的检测方式被应用于食品微生物检测领域。其中，免疫磁珠技术与PCR 技术，近年成为人们瞩目的焦点，备受推崇。

免疫磁珠技术是通过磁性微球与抗体相结合，借助磁场之力，捕获微生物，具有独特的分辨能力和反应速度。PCR 技术通过扩增目标微生物的核酸片段，可以迅速辨识目标。将两种技术相互融合，能最大限度地展现各自优势，快速检测大肠杆菌。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

免疫磁珠分离仪器；扩增基因仪器；显微镜；微生物之核；基因采样器；大肠杆菌特异性引物与探针；塔克DNA 聚合酶；dNTPs[1]；10×PCR buffer。

1.2 样品来源

本次研究共测试了50 个食品样本，包括肉类、乳制品、蔬菜等，所有样本都源自附近的超市与农贸市场。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫磁珠富集

取25 g 样本，溶入225 mL 消毒生理盐水中，制备成1 ∶10 的稀释液，确保充分混合。将稀释后的样品液经过免疫磁珠分离柱进行处理，采用免疫磁珠分离技术，成功筛选出目标大肠杆菌。将免疫磁珠上的大肠杆菌清理干净，进而将其收集至离心管内，备用。

1.3.2 DNA 提取与PCR 扩增

（1）借助细菌基因组DNA 提取试剂盒，成功提取大肠杆菌的基因组DNA。具体操作步骤如下：免疫磁珠上的大肠杆菌被清洗，最终汇集到离心管里，添加适量裂解液，轻轻搅拌使之均匀；蛋白酶K 与硅藻土混合均匀后移至吸附柱内，遵循试剂盒操作手册进行后续步骤，获取清澈的基因组DNA。

（2）采用特异性引物与探针实施PCR 扩增[2]。反应体系50 μL，内含DNA 模板、特异性引物、探针、Taq DNA 聚合酶、dNTPs 以及PCR 缓冲液。PCR 反应的过程，PCR 扩增开始于95 ℃下的5 min 预变性步骤，接着进行40 个循环，每个循环包括90 ℃下的变性步骤持续30 s，55 ℃下的退火步骤持续30 s，以及72 ℃下的延伸步骤持续30 s。最后，进行一个最终延伸步骤，在72 ℃下持续10 min。

2 结果与分析

2.1 免疫磁珠分离结果

通过免疫磁珠分离技术，本研究从50 份食品样品中成功分离出大肠杆菌，分离率达100%，具体数据如表1、图1 所示。

图1 免疫磁珠分离结果折线图

表1 免疫磁珠分离结果表

总体来说，针对各类食品样本，免疫磁珠分离技术皆能实现100%的分离效果，为大肠杆菌的检测赋予了极高的精确度和可信度[3]。然而，对于食品安全性的全面评估，还需依赖多种检测手段与深入的综合分析。

2.2 PCR 扩增结果

对大肠杆菌分离物进行PCR 扩增，扩增产物随之呈现。PCR 产物经过2%琼脂糖凝胶电泳进行分析，所有样本皆呈阳性反应，确认已检测到大肠杆菌，具体数据如表2 所示。

表2 PCR 扩增结果表

如表2 所示，PCR 扩增结果显示，在肉类、乳制品和蔬菜这3 类样品中，每一类的所有样本都呈阳性反应。具体来说，肉类样品有20 个，乳制品和蔬菜样品各有15 个，它们的阳性率均达到了100%。这表明在所有测试的样品中，目标DNA 都成功地被扩增出来。

阳性率的百分比，就是成功扩增的样品在总样品数量中所占的比重[4]。在本研究中，肉类、乳制品与蔬菜的阳性率皆达到100%，由此可见，在这3 种食物中，所有样本皆检出大肠杆菌，PCR 扩增过程得以顺利进行。

2.3 大肠杆菌数量检测结果

对50 份食品样品进行大肠杆菌数量检测，结果如表3 所示。

表3 大肠杆菌数量检测结果表

本研究对50 份食品样本进行了剖析，结果显示[5]，在肉制品样本中，大肠杆菌含量介于<10～104 CFU·mL-1区间，平均数值约为5.3×103 CFU·mL-1，说明肉类样本里存在一定规模的大肠杆菌。乳制品样品中大肠杆菌的数量区间为<10～9.8×103 CFU·mL-1，平均值为4.2×103 CFU·mL-1，可见，乳制品中的大肠杆菌含量相对较少。蔬菜样本中，大肠杆菌的数量分布为<10～7.6×103 CFU·mL-1，平均值为3.4×103 CFU·mL-1。相较于肉类与乳制品，蔬菜的大肠杆菌含量相对较低，但食品安全问题仍需密切关注。

3 结语

本研究运用免疫磁珠与PCR技术相结合的方式，对食品中大肠杆菌实施了迅速检测。经实验证实，此法具备较高的精确性与敏感度，可以用于食品微生物检验中大肠杆菌的快速检测。①免疫磁珠技术可以成功地从食品样本中筛选出大肠杆菌，其分离效果高达100%，可提升检测的专一性。②采用PCR技术，可以对免疫磁珠分离出的大肠杆菌进行核酸扩增。借助特异性引物与探针，可以保证扩增结果的专属性与敏锐度。③PCR 产物经过琼脂糖凝胶电泳分析，检测结果显示，所有样本皆为阳性，进一步验证了此方式的稳定性。④本研究进一步探讨了各类样品中大肠杆菌的数量分布特点。数据显示，肉类与乳制品中大肠杆菌含量相对较多，蔬菜中大肠杆菌的含量相对较少，其原因与食品的加工方式和储存环境有关。

免疫磁珠与PCR 技术相结合，具备高效、精确、灵敏度高的特点，可以为大肠杆菌的快速检测提供有力保障。未来，结合其他新兴技术，如纳米科技、生物传感器等，可以增强检测的敏锐性与专一性。