一步法在泌尿生殖系统感染病原体核酸检测中的临床应用评价

黄国妮 颜申姬 程静 谢闰萍

泌尿生殖系统感染包括生殖道、泌尿道和性传播的流行性传染病，已成为公共卫生系统中最常见的传染病之一［1-2］。感染病原体常见的包括沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，CT）、解脲支原体（Ureaplasma urealyticum，UU）、淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhea，NG）、人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）、单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus，HSV）和阴道毛滴虫等［3］。可引起多种泌尿生殖系统疾病，超过99%的宫颈癌和超过90%的肛门癌是由HPV 阳性引起的［4］。CT 和NG都可能会引起输卵管损伤，不仅可能引起盆腔炎和女性不孕，还会增加异位妊娠和流产、早产的风险［5］。新生儿如果从阳性的母体中感染HSV，可能会累及中枢神经系统并造成严重后果［6］。随着分子诊断技术的发展，近年来分子诊断产品实现了大规模的生产和应用。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）兼具特异性强和灵敏度高等优点，逐渐成为泌尿生殖系统感染疾病诊断的主要检测手段之一，尤其适用于感染的早期诊断和无症状感染者的检测［7］。

PCR 包括三个主要步骤：核酸提取纯化、核酸扩增和核酸检测。核酸提取是最基础的步骤之一，并且是许多分子诊断实验的先决条件，提取的核酸的质量和完整性将直接影响后续实验检测的结果［8］。传统的煮沸法是目前临床上应用较为广泛的提取方法，但是需要经过反复离心和加热等繁琐步骤，同时加热的过程中极易产生气溶胶，导致样品间污染产生假阳性结果［9］。近年来一步法提取试剂在市场上逐渐得到应用推广，通过释放剂和少量样品直接反应即可获得适用于扩增的核酸成分，在速度、经济和效率等方面均具有巨大的优势［10］。作为一种较新颖的提取方法，目前关于一步法用于泌尿生殖系统感染临床样本检测的研究相对较少，本研究将探讨其用于泌尿生殖系统感染病原体核酸检测的可行性，为一步法实现广泛的临床应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2021 年3 月至2021 年8 月期间到深圳市宝安区人民医院门诊就诊的200 例泌尿生殖道感染患者作为本次研究对象，其中男性95 例，女性105 例，年龄在20～66 岁之间。纳入标准：所有患者根据临床表现均被确诊为泌尿生殖系统感染；首次就诊；对本研究知情同意。排除标准：纳入患者就诊前2 周有抗生素使用史；严重器质性功能异常者；合并其他阴道疾病者；认知功能障碍者；拒绝参与本研究者。采集样本包括宫颈分泌物和尿道分泌物，所有采集过程均按无菌操作进行。

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1 试剂

一步法样本释放剂由湖南圣湘生物科技有限公司购入，煮沸法核酸提取试剂和病原体基因检测试剂均由中山大学达安基因股份有限公司提供。

1.2.2 仪器

实时荧光定量PCR 分析仪（Cobas z480，德国Roche）、高速冷冻离心机（Centrifuge 5430R，德国Eppendorf）、Bioer 恒温金属浴。

1.3 实验方法

1.3.1 病原体阳性率统计

本院2021 年1 月至2021 年3 月泌尿生殖系统感染患者的病原体感染情况。见表1。

表1 1 225 例泌尿生殖系统感染患者荧光定量PCR检测结果（n，%）Table 1 Test results of PCR in 1 225 patients with urogenital infection（n，%）

1.3.2 核酸提取

在采集到的样本中加入1 mL 生理盐水，充分振荡混匀样本。①一步法：吸取200 μL 样本至0.5 mL 离心管中，12 000 r/min、离心半径6 cm 离心5 min 后去上清，加入50 μL 核酸释放剂充分振荡混匀后静置10 min，获得一步法核酸模板待测。②煮沸法：吸取200 μL 样本至0.5 mL 离心管中，12 000 r/min、离心半径6 cm 离心5 min 后去上清，加入50 μL DNA 提取液充分振荡混匀，放入100℃恒温仪中处理10 min，12 000 r/min、离心半径6 cm 离心5 min 后获得煮沸法模板待测。

1.3.3 一致性实验

按照试剂盒说明书的操作要求，分别将上述经处理的核酸模板和PCR 反应液混匀，按设定的程序上机扩增，对扩增后的结果按说明书要求进行判读。比较两种提取方法所得阳性检出率的一致性。

1.3.4 灵敏度实验

分别选取三种检测项目中的阳性样本进行10-1～10-4的梯度稀释，获得不同浓度的阳性样本分别使用一步法和煮沸法进行核酸提取后进行PCR扩增，各样本均重复测量3 次，比较两种提取方法的提取灵敏度。

1.3.5 抗干扰性实验

留取健康人血性分泌物样本（外观红褐色或红色，通过病原体核酸检测结果均为阴性）10 例，振荡混匀后备用；健康人黏性分泌物样本（外观浑浊或胶冻状，通过病原体核酸检测结果均为阴性）10 例，振荡混匀后备用。选取三种检测项目中阳性样本各一例，每例均分为3 管为一组，每组分别加入生理盐水、血性样本和黏性样本进行10 倍稀释。分别使用一步法和煮沸法对以上3 组样本进行核酸提取和扩增，各样本均重复测量3 次。运用公式：干扰偏移%=（干扰值-对照值）/对照值×100% 作为干扰实验的判断标准。

1.3.6 精密度实验

分别选取三种检测项目中高浓度及低浓度阳性样本各两例，由同一检测人员分别使用一步法和煮沸法平行重复做5 次核酸提取，连续进行5 天，进行PCR 扩增后记录相应阳性结果的Ct 值，计算变异系数CV 值，比较两组提取方法的提取重复性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行数据分析，图表使用GraphPad Prism 8.0 软件绘制。计数资料以n（%）表示。一致性实验结果分析使用kappa 检验，Kappa 值≥0.75 时一致性良好，0.4 ≤Kappa ＜0.75时一致性一般，Kappa ＜0.4 则表示两者一致性差。

2 结果

2.1 两种提取方法的一致性比对

200 例泌尿生殖道感染患者样本用两种提取方法提取扩增后结果见表2，一步法和煮沸法对CT、UU 和高危HPV 的阳性率分别为9.5%、39.5%、7.5%和10.5%、38.5%、8.0%，有5 例样本出现结果不符，对阳性率一致性进行Kappa 检验，Kappa 值为0.949，一致性良好。

表2 两种提取方法的检测结果比较［n（%）］Table 2 Test results of the two extraction methods［n（%）］

2.2 两种提取方法的灵敏度比对

在1∶103的稀释浓度范围内，两种提取方法均可以检测出相应的阳性结果；对选取的高危HPV阳性样本两种提取方法可检测出最高1∶105的稀释浓度。见图1。

图1 两种提取方法的提取灵敏度比较Figure 1 Comparison of sensitivity between the two extraction methods

2.3 两种提取方法的抗干扰能力比对

两种提取方法的干扰偏移均在10%以内。见表3。

表3 两种提取方法的抗干扰结果比较Table 3 Comparison of anti-interference ability between the two extraction methods

2.4 两种提取方法的精密度比对

两种提取方法的批内和批间精密度结果见图2。结果显示一步法的批内精密度在2.17%～4.86%之间，批间精密度在2.70%～4.77%之间；煮沸法的批内精密度3.94%～4.35%之间，批间精密度在3.50%～4.91%之间，两种提取方法的CV 值均在5%以内。

图2 两种提取方法的精密度结果Figure 2 Comparison of repeatability between the two extraction methods

3 讨论

PCR 包括三个主要步骤：核酸提取纯化、扩增和检测。目前临床上有多种用于核酸提取的方法：柱式法，操作复杂需要重复离心且采用特殊滤膜成本较高等原因，虽提取纯度较高但在临床上难以推广应用。磁珠法，以磁珠吸附的方式进行核酸提取，自动化核酸提取仪的生产和应用实现了临床上大批量样本的操作要求，目前市面上自动化核酸提取仪提取时间为18～45 分钟，提取较费时，同时对仪器设备的要求较高限制了其在基层医院的推广和应用。煮沸法是目前临床上应用比例较高的提取方法，需要重复离心加热等繁琐步骤，加热的过程中极易产生气溶胶，导致样品间污染。一步法将待测样本和样本释放剂混合均匀，反应时间仅需10 分钟左右无需加热，与传统煮沸法相比具有更快速、操作更简单的方法学优势［11］。本研究通过一步法与传统煮沸法在泌尿生殖系统感染病原体核酸检测中的一致性、灵敏度、抗干扰能力和重复性进行了对比，验证一步法用于泌尿生殖系统病原体核酸检测的可行性。

一致性实验结果显示200 例样本中仅出现了有5 例不符样本，对这5 例不符样本进行测序结果显示，2 例一步法阳性煮沸法阴性测序结果2 例样本均为阳性，这两例样本均为弱阳性样本（Ct 值37.5～38.73），表明一步法具有更优异的提取效率；3 例煮沸法阳性一步法阴性测序结果为2 例阴性、1 例阳性，推测煮沸法导致此2 例假阳性结果的可能原因是煮沸法加热离心的步骤易出现气溶胶污染导致假阳性结果。总体而言，两种提取方法的kappa 检验结果具有较高的一致性。

临床样本中干扰PCR 检测结果的因素主要有胆红素、血红蛋白、免疫球蛋白、肝素等。在分泌物中常见的干扰样本类型为血性分泌物和黏性分泌物；血性分泌物中含有的血红蛋白和黏液标本中含有的黏蛋白和多糖等成分均会抑制DNA 聚合酶的活性，对PCR 结果造成影响［12-13］。本实验中两种提取方法均对血性分泌物和黏性分泌物具有一定的抗干扰能力。

灵敏度实验和重复性实验结果显示这两种提取方法比较无显著性差异。一步法的提取过程只需要简单的操作步骤即可获得与传统煮沸法相同甚至灵敏度更高的实验结果，节省了相应的仪器耗材和时间成本，更重要的是可以节约检验时间使患者和临床更快速获得检验报告减少等待时间，具有极大的临床应用价值。

目前关于一步法的临床应用研究国内外亦有相应的文献报道，张运洪等［14］通过实验结果认为一步法缺少核酸提取的过程，对弱阳性的新型冠状病毒容易出现漏检的风险，不适用于新型冠状病毒核酸检测。表明一步提取法具有其方法学优势的同时亦有其方法学缺陷，应用于临床不同的检测项目前需要先对其适用性进行方法学评价，本研究认为一步法在泌尿生殖系统病原体感染核酸检测项目中具有非常好的临床应用能力。