非心源性脑梗死患者miR-124、miR-210 表达与颈动脉狭窄的关系

曹秋菊 张利娟 李圆圆

脑梗死是脑部血液供应障碍、血管闭塞致局部脑组织缺血缺氧而引起的一种神经功能缺失表现，也称缺血性脑卒中。脑梗死在临床多表现为突发性的昏倒、意识丧失，语言智力障碍等［1］。根据脑梗死发病原因可分为心源性和非心源性，心源性往往自身具有心血管疾病，临床常予以预防手段；而非心源性患者因无明显诱因易被忽视，常以急性脑梗死为主，对患者的生命威胁更大。颈动脉粥样硬化斑块脱落是非心源性脑梗死的常见原因，颈动脉狭窄程度也与脑梗死病变程度密切相关，且颈动脉狭窄的患者脑梗死复发率也较高［2］，故认为对非心源性脑梗死患者颈动脉狭窄情况进行评估对其临床诊疗具有重要意义。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类由20～25 个核苷酸组成的小分子单链RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用［3］。miR-124，miR-210具有调控血管生成、介导细胞氧化应激的作用，在血管类疾病和代谢性疾病中具有重要地位［4-5］。本研究将探讨非心源性脑梗死患者miR-124、miR-210表达与颈动脉狭窄的关系，以期为临床诊疗补充循证依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究获取院方伦理委员会通过，选取2021年1 月至2022 年12 月成都医学院第二附属医院·核工业四一六医院收治的124 例非心源性脑梗死患者作为观察对象，根据是否存在颈动脉狭窄分为狭窄组（n=64）和无狭窄组（n=60）。纳入标准：①符合非心源性脑梗死标准［6］，且经MRI 影像学确诊；②狭窄组患者均经颈动脉超声确诊存在斑块或有内膜增厚［7］；③患者家属对研究内容了解并同意入组。排除标准：①合并心血管疾病；②合并恶性肿瘤；③精神疾病或意识障碍；④临床资料缺失者。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-124、miR-210表达水平检测

均于入院时抽取患者静脉血3 mL，采用Ficollhypzue 细胞分离液（美国phannacia 公司）分离出外周血单个核细胞。采用Trizol 试剂（上海双达生物技术有限公司）抽提单核细胞中总RNA，计算RNA的浓度和纯度。按TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit 逆转录试剂盒说明书（北京伊塔生物科技有限公司）以RNA 为模板进行逆转录获得cDNA 并置于4℃保存。实时荧光定量法进行血清miR-124、miR-210相对表达量测定，以U6为内参，2-ΔΔCT法表示表达水平，反应体系为20 μL。miR-124反应条件为：95℃15 s，60℃60 s，85℃15 s，60℃15 s，设置40 个循环。miR-210反应条件为：95℃15 min、94℃20 s、60℃34 s，设置40 个循环。引物序列：U6：上游引物序列：5′-TGCGGGTGCTCCGCTT-3′，下游引物序列：5′-CAGTGCAGGGTCCGA-3′；miR-124：上游引物序列：5′-GATACTCATAAGGCAC GCGG-3′；下游引物序列：5′-GTGCAGGGTCCGAG GT-3′。miR-210：上游引物序列：5′-CGTGTGAGAGCGGCTGAAA-3′；下游引物序列：5′-TATGGTTGTTCTTCTCGTCTCCTTCTC-3′。

1.2.2 血清超敏C 反应蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）、同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）检测

抽取患者空腹静脉血3 mL，分离血清（3 500 r/min，10 min，离心半径8 cm），提取上清液，采用ELISA 法检测Hcy、hs-CRP 水平（试剂盒：上海酶研生物科技有限公司）。

1.2.3 颈动脉狭窄程度分级［7］

轻度狭窄为＜30%；中度狭窄为30%～70%（包含30%）；重度狭窄为70%及以上。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0 统计学软件进行处理并分析，计量资料经检验后满足正态分布以（）表示，两组间行t检验，多组间用方差分析；计数资料用n（%）表示，行χ2检验；采用Pearson 相关性分析相关指标，采用Spearman 相关性分析不同狭窄程度与血清miR-124、miR-210的相关性，以P＜0.05 时为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较

两组一般资料（年龄、性别、BMI、基础疾病、家族遗传史、吸烟史、饮酒史）比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 两组一般资料比较［（），n（%）］Table 1 Comparison of general data between the two groups［（），n（%）］

表1 两组一般资料比较［（），n（%）］Table 1 Comparison of general data between the two groups［（），n（%）］

2.2 两组血清miR-124、miR-210 表达水平比较

狭窄组血清miR-124、miR-210表达水平均低于无狭窄组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 两组血清miR-124、miR-210 表达水平比较（）Table 2 Comparison on expression levels of serum miR-124 and miR-210 between the two groups（）

表2 两组血清miR-124、miR-210 表达水平比较（）Table 2 Comparison on expression levels of serum miR-124 and miR-210 between the two groups（）

2.3 两组血清hs-CRP、Hcy 水平比较

狭窄组血清hs-CRP、Hcy 水平高于无狭窄组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 两组血清hs-CRP、Hcy 水平比较［（），mg/L］Table 3 Comparison of serum hs-CRP and Hcy levels between the two groups［（），mg/L］

表3 两组血清hs-CRP、Hcy 水平比较［（），mg/L］Table 3 Comparison of serum hs-CRP and Hcy levels between the two groups［（），mg/L］

2.4 不同颈动脉狭窄程度患者血清miR-124、miR-210 表达水平比较

重度狭窄组患者的血清miR-124、miR-210表达水平均低于轻度和中度狭窄组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 不同颈动脉狭窄程度患者血清miR-124、miR-210表达水平比较（）Table 4 Comparison on expression levels of serum miR-124 and miR-210 in patients with different severity of carotid stenosis（）

表4 不同颈动脉狭窄程度患者血清miR-124、miR-210表达水平比较（）Table 4 Comparison on expression levels of serum miR-124 and miR-210 in patients with different severity of carotid stenosis（）

注：与轻度狭窄组比较，aP＜0.05；与中度狭窄组比较，bP＜0.05。

2.5 不同颈动脉狭窄程度患者血清hs-CRP、Hcy水平比较

hs-CRP、Hcy 水平：重度狭窄组＞中度狭窄组＞轻度狭窄组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表5 不同颈动脉狭窄程度患者血清hs-CRP、Hcy 水平比较［（），mg/L］Table 5 Comparison of serum hs-CRP and Hcy levels in patients with different severity of carotid stenosis［（），mg/L］

表5 不同颈动脉狭窄程度患者血清hs-CRP、Hcy 水平比较［（），mg/L］Table 5 Comparison of serum hs-CRP and Hcy levels in patients with different severity of carotid stenosis［（），mg/L］

注：与轻度狭窄组比较，aP＜0.05；与中度狭窄组比较，bP＜0.05。

2.6 血清指标间及与颈动脉狭窄程度的相关性

hs-CRP、Hcy 水平与颈动脉狭窄程度均呈正相关（P＜0.05），miR-124、miR-210与hs-CRP、Hcy水平、颈动脉狭窄程度均呈负相关（P＜0.05）。见表6。

表6 血清指标间及与颈动脉狭窄程度相关性Table 6 Correlation among serum indexes and their correlation with carotid stenosis

3 讨论

颈动脉粥样硬化斑块脱落是非心源性脑梗死常见病因，颈动脉狭窄程度与病变程度及复发风险有关，故对颈动脉狭窄程度进行评估具有重要意义。

既往有研究显示［8］，在由颈内动脉狭窄导致的急性冠状动脉综合征（ACS）或缺血性脑卒中中，miRs是潜在的重要诊断和预后生物标志物。本研究结果显示，狭窄组患者血清miR-124、miR-210表达水平均低于无狭窄组，说明miR-124与miR-210可能与颈动脉狭窄发生有关。分析其原因可能是，miR-124可有效增加抗调亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xl）表达，促进M2 表型小胶质细胞/巨噬细胞生成，具有减轻神经炎性反应、抑制神经元调亡、减少缺血性脑损伤的作用，在神经血管重塑中具有重要地位［9］，当其水平降低，说明脑缺血症状严重，可能与狭窄形成有关。既往也有研究［10］提出，miR-124是真核生物中保守的非编码RNA，是调控基因表达的关键途径，在中枢神经功能调节和脑发育中具有重要地位。miR-210是一种缺氧激活因子，可在缺氧环境中促进新生血管生成，改善机体缺血缺氧状态。一项动物实验［11］表明，miR-210可促进脑缺血后血管新生，与脑梗死的疾病进展有关。在颈动脉狭窄形成初期，脑供血处于微缺氧状态，此时miR-210水平仍处于较高水平状态，但出现严重脑出血时，血管堵塞严重，此时机体呈现低氧状态，miR-210受低氧诱导因子的诱导转录，水平降低，促进颈动脉狭窄发展。本研究结果与既往研究部分相似［12-14］。

炎性反应和氧化应激是动脉粥样硬化斑块形成的病理基础。本研究结果显示，狭窄组hs-CRP、Hcy 水平高于非狭窄组。分析其原因是，hs-CRP是机体炎性反应标志物，可激活多种补体系统，合成和释放炎性介质，生成氧化自由基分子，损害血管内皮细胞，促进动脉粥样硬化斑块的形成，形成动脉狭窄。Hcy 属于氨基酸的一种，正常情况下在机体内浓度水平较低，而当Hcy 代谢异常时，可引起机体糖脂代谢紊乱，导致机体脂质物堆积，促进动脉粥样硬化斑块形成；Hcy 还可促进低密度脂蛋白进行自我氧化，形成氧化修饰低密度脂蛋白，被巨噬细胞摄取转变为泡沫细胞而损害血管内皮细胞功能［15］，进一步加速动脉粥样硬化，形成颈动脉狭窄。既往亦多有研究证实hs-CRP、Hcy 水平增高与脑梗死患者颈动脉狭窄的关系［16-17］。进一步研究说明miR-124、miR-210可能通过调控hs-CRP、Hcy 促进颈动脉狭窄形成，提示血清miR-124、miR-210表达水平可成为评估颈动脉狭窄的辅助性指标，为临床诊疗提供指导。

综上所述，miR-124、miR-210可能参与颈动脉狭窄的形成，其表达水平检测或可作为评估非心源性脑梗死颈动脉狭窄程度的辅助性指标。