猪圆环病毒2型疫苗抗原定量方法及其应用

文｜何召庆* 徐晨 汪爱芬 尹秀凤 南祥祝 邵营格 晁锦［兆丰华生物科技（南京）有限公司］

猪圆环病毒病是一种可以给猪场造成严重经济损失的疾病，当前，猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus type 2，PCV2）感染在很多猪场仍有很高的比例，给猪场管理带来了巨大压力。有效的疫苗免疫有利于猪抵抗病毒，减少病毒血症的发生和缩短带毒时间，因此，疫苗免疫仍是猪场控制PCV2的重要手段。

疫苗质量是有效防控猪圆环病毒2型的关键。目前，我国已批准上市的PCV2单苗和圆环病毒与支原体二联灭活疫苗（简称圆支二联灭活疫苗）共20种左右，生产企业数量多达60个左右，不同类型PCV2疫苗检验方法差异较大，这些疫苗产品没有统一的标准，有的疫苗采用免疫攻毒试验法进行效力检验，有的疫苗通过抗体检测法进行效力检验，还有的疫苗通过双抗夹心ELISA进行抗原含量检测和相对效力法进行检验。免疫攻毒法和抗体检测法需要用到试验动物，操作烦琐，耗时耗力，重复性差，而双抗夹心ELISA蛋白定量法存在误差较大和毒株差异性等问题。不适合一般实验室和养殖企业对多种不同来源的PCV2疫苗抗原含量的检测比较。

临床上如何选择质量更好的疫苗是养殖企业面临的难题。虽然疫苗佐剂、制备工艺等均可影响产品质量，但对于PCV2全病毒灭活疫苗或其Cap蛋白亚单位疫苗而言，抗原精准定量检测对评价疫苗质量非常重要。抗原含量是评估疫苗质量的重要指标之一，直接影响疫苗的接种效果。

国内商品化的PCV2疫苗有4类，包括全病毒灭活疫苗、基因工程亚单位疫苗（有真核表达和原核表达之分）、嵌合病毒灭活疫苗和合成肽疫苗。这些疫苗中的圆环病毒抗原有的是全病毒，有的是Cap蛋白，实际上也不能排除既有全病毒也有Cap蛋白的可能性。

近十多年来，利用超速离心配合高效液相色谱技术，我国口蹄疫疫苗146S含量检测方法在疫苗生产企业和集团化养猪企业中得到应用，极大促进了口蹄疫疫苗的质量控制。中国科学院基于高效体积排阻色谱（HPSEC）偶联多角度激光散射仪（MALLS），建立了PCV2灭活疫苗及病毒样颗粒疫苗抗原含量检测方法。但该方法对仪器设备的要求较高，一般实验室不容易实现日常检测。

借鉴上述技术要点，为了建立费用低、速度快且能精准定量PCV2相关疫苗有效抗原含量的方法，帮助养殖企业筛选优质疫苗。本研究采用普通的离子交换层析技术，通过筛选试验材料，通过多次试验、不同方法对各种样品进行验证，最终建立了一套可快速、精准定量各种PCV2相关疫苗全病毒及其Cap蛋白抗原含量的方法，且成本更低，适合在规模化猪场推广使用。

一、试验材料

1.主要仪器与设备。蛋白纯化仪，AKTA。微量分光光度计，Thermo scientific公司。

2.主要试剂。层析填料，苏州蓝晓生物科技有限公司。

3.试验样品种类与编号。PCV2全病毒细胞培养液（A）；PCV2 Cap蛋白真核表达细胞培养液（B）；PCV2 Cap蛋白原核表达细菌培养液（C）；油佐剂PCV2灭活疫苗（D）；水佐剂PCV2灭活疫苗或者水佐剂圆支二联灭活疫苗（E）。

二、试验方法

1.试验样品处置。

（1）PCV2全病毒细胞培养液处置。取PCV2全病毒细胞培养液1.5毫升至Eppendorf管中，反复冻融3次，12000转/分，4℃高速离心3分钟，取1毫升上清备用。共试验3批细胞培养液，分别标记为A1、A2和A3。

（2）PCV2 Cap蛋白真核表达细胞培养液处置。取表达PCV2 Cap蛋白的昆虫细胞培养液1.5毫升至Eppendorf管中，反复冻融3次，12000转/分，4℃高速离心3分钟，取1毫升上清备用。共试验3批细胞培养液，分别标记为B1、B2和B3。

（3）PCV2 Cap蛋白原核表达细菌培养液处置。取可溶性表达PCV2 Cap蛋白的大肠杆菌培养液1.5毫升，离心获得菌体，用15毫升PBS重悬菌体作10倍稀释，菌体经超声破碎，12000转/分，4℃高速离心3分钟，取1毫升上清备用。共试验三批细菌培养液，分别标记为C1、C2和C3。

（4）油佐剂PCV2灭活疫苗处置。取油佐剂PCV2灭活疫苗700微升，按1∶1体积比加入700微升三氯甲烷，振荡混匀，12000转/分，4℃离心6分钟，用移液器取出所有上层水相液体，计算水相体积/疫苗体积，计为R1。取200微升备用。共试验两家企业的油佐剂PCV2疫苗共4批。分别标记为D1、D2、D3和D4。

（5）水佐剂PCV2相关疫苗处置。取700微升水佐剂PCV2疫苗，按1∶1体积比加入700微升三氯甲烷，振荡混匀，12000转/分，4℃离心3分钟，用移液器取出所有上层水相液体，计算水相体积/疫苗体积，计为R1。取200微升备用。其中三家企业的水佐剂PCV2相关疫苗共3批，分别标记为E1、E2和E3。

2.PCV2全病毒或Cap蛋白层析纯化。将200微升按（1）～（3）方法处置的试验样品，用PBS稀释至5毫升，利用AKTA蛋白纯化系统按照已经建立的PCV2全病毒/Cap蛋白层析纯化标准操作程序，进行离子交换层析纯化。收集起峰段样品，稀释至5毫升。

采用SDS-PAGE结合灰度分析测定样品纯化前后PCV2全病毒或Cap蛋白纯度。利用BCA法和分光光度法测定样品纯化前后总蛋白浓度。计算PCV2全病毒或Cap蛋白回收率。

3.建立PCV2全病毒或Cap蛋白含量检测方法及计算公式。根据上述试验数据和结果进行分析，建立PCV2全病毒或Cap蛋白含量检测流程，具体如下。

（1）样品处置。

（2）离子交换层析纯化。

（3）分光光度法测定总蛋白含量。

（4）计算原始样品中的PCV2全病毒或Cap蛋白含量。

具体计算公式如下：

其中，C（s）为待检样品中PCV2全病毒或Cap蛋白含量（微克/毫升）；C（t）为分光光度计测定的稀释后起峰段样品中总蛋白含量（微克/毫升）；P为纯度，在本公式中取常数0.65；R1为待检样品的水相占比；R2为回收率，在本公式中取常数0.82。

三、方法应用

对待检疫苗样品分别用（4）～（5）方法进行前处置，按照已建立的层析-分光光度法进行PCV2抗原含量检测，并通过已建立的PCV2抗原含量计算公式进行计算。

四、结果与讨论

3种不同来源的抗原，经过前期处理和层析纯化，通过SDS-PAGE结合灰度分析法可测定样品纯化前后PCV2全病毒或Cap蛋白纯度。通过BCA法和分光光度法测定样品纯化前后总蛋白浓度，可以计算得到每次纯化检测的回收率。结果见表1、表2和表3。

表1 PCV2全病毒细胞培养液层析前、后回收率

表2 PCV2 Cap蛋白真核表达细胞培养液层析前、后回收率

表3 PCV2 Cap蛋白原核表达细菌培养液层析前、后回收率

用所建立的方法检测了4种油佐剂PCV2灭活疫苗抗原含量，结果见表4。

表4 油佐剂PCV2灭活疫苗抗原含量检测结果

用所建立的方法检测了3种水佐剂PCV2灭活疫苗抗原含量，结果见表5。

表5 水佐剂PCV2灭活疫苗抗原含量检测结果

本研究是在前期多次预试验的基础上进行的，经过多次筛选，最终确定了一种适合圆环病毒2型及其Cap蛋白纯化的层析填料，包括洗脱液浓度、时间等过程参数的确定，使其回收率和纯度非常稳定。需要说明的是，本研究确定的计算公式仅限于按照确定的材料和设备进行操作，并非可以任意更换试验材料和设备后还适用。

毫无疑问，由于层析纯化过程不可避免地存在回收率差异，该方法也一定会存在误差，但与双抗夹心ELISA法和免疫层析法等免疫学定量方法相比，从原理上决定了本研究建立的方法误差范围会小于上述两种方法。比较适合临床评价猪圆环病毒2型相关疫苗质量。从临床检测圆环病毒2型相关疫苗抗原的结果看，不同厂家的产品确实存在较大差异。

该方法不适用于PCV2合成肽疫苗抗原的定量检测。