痛风基因表达谱的差异基因表达及免疫细胞浸润分析

陈锋 李华南 章晓云 黄慧莲 陈跃平 任国武 （.广西中医药大学附属瑞康医院骨科，南宁 500；.江西中医药大学附属医院，南昌 0006；.江西中医药大学，南昌 0004）

痛风是人类最常见的代谢性风湿病之一，其特征为单钠尿酸盐（monosodium urate，MSU）晶体慢性沉积，导致反复发作的痛风性关节炎、痛风石、肾结石和痛风性肾病［1］。流行病学证据表明，从1990年到2017年，痛风在中国的患病率和发病率分别增长了6.88%和6.16%，其变化幅度远高于全球水平，但具体发病机制尚不清楚［2］。随着免疫学机制在骨科疾病中的应用，越来越多研究发现免疫系统与骨骼之间存在共享分子和相互作用。研究表明，关节滑膜组织中除了滑膜细胞还包含巨噬细胞、肥大细胞和中性粒细胞，在痛风性关节炎的发病机制中这些免疫细胞的异常活化会促进关节炎症和MSU晶体的形成［3-4］。因此，深入研究痛风潜在的免疫细胞作用机制，发现安全有效的诊疗靶点非常重要。

本研究从基因表达数据集（gene expression omnibus，GEO）下载痛风患者的基因表达谱数据，进行差异基因表达和信号通路分析，再通过免疫细胞浸润分析各免疫细胞在痛风患者及健康对照者中的表达情况，最后分析痛风差异基因、信号通路与免疫细胞间的作用关系，为研究痛风发病的相关免疫机制提供新的见解，并确定痛风的预期靶点。

1 资料与方法

1.1 筛选痛风的相关芯片 以“Gout”“Human”“Peripheral blood”为关键词，在GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中检索痛风的相关芯片，获得编号为GSE160170的芯片矩阵文件和编号为GPL21827的平台文件。该芯片中共纳入12例样本，其中6例为痛风患者外周血，6份为健康对照者外周血。

1.2 重注释比对 将平台文件中的探针核酸序列整理为fasta格式，在Gencode数据库（https：//www.gencodegenes.org/）下载人类染色体上所有转录物的核苷酸序列文件，运用R语言（版本4.1.1）将探针核酸序列与人类染色体上所有转录物的核苷酸序列文件进行比对，得到含有基因名的探针文件。

1.3 芯片数据分析 运用Perl语言（版本5.34.0）将矩阵文件与探针文件比对，获得痛风患者和健康对照者的基因表达谱数据集。然后利用R语言的limma包对数据进行校正，再进行差异分析。以P＜0.05和|log2fold change （FC）|＞1.2作为过滤条件，筛选出存在差异表达的基因，最后运用R语言的pheatmap绘制差异基因聚类热图。

1.4 蛋白互作网络构建 为进一步探究痛风的蛋白质相互作用关系，将差异基因导入蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）分析数据库STRING（https：//string-db.org/）中，设定研究物种为“Homo Sapiens”，并设置连接评分＞0.98，获得PPI网络。将所得结果导入Cytoscape软件中（版本3.7.2），利用“NetworkAnalyzer”工具进行可视化处理，并利用“CytoHubba”工具根据度值筛选出关键基因。

1.5 关键基因的功能富集分析 使用R语言的clusterProfiler包对关键基因进行基因本体论（Gene ontology，GO）及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，研究痛风发生发展的主要生物功能及相关信号通路，最后运用R语言的ggplot2包绘制GO及KEGG富集分析气泡图。

1.6 免疫细胞分析法 利用R语言CIBERSORT（https：//cibersort.stanford.edu/）包中的反卷积算法及其提供的22种免疫细胞转录特征矩阵，对痛风患者血清的基因表达谱数据进行1 000次模拟，计算各样本中不同免疫细胞占比，并分析痛风患者外周血和健康对照组中免疫细胞的差异性，从而获得免疫细胞浸润及分布情况；然后用R语言的barplot、pheatmap、corrplot、vioplo及ggplot2包分别绘制免疫细胞分布柱状图、免疫细胞聚类热图、免疫细胞间的相关性热图、小提琴图以及主成分分析（principal components analysis，PCA）图。

2 结果

2.1 痛风差异基因的分析 利用perl和R语言等工具对芯片进行重注释后，再对其进行分析。结果显示，与健康对照组相比，痛风患者共存在858个明显改变的基因，其中496个基因表达上调，362个基因表达下调。选取差异表达最显著的20个基因（表达上调和表达下调的基因中各选取10个）绘制聚类热图，见图1。

图1 痛风患者与健康对照组差异基因的聚类热图Fig.1 Clustering heat map of differential genes between gout patients and healthy controls group

2.2 PPI网络 借助STRING数据库对差异基因进行分析，并将结果导入Cytoscape软件绘制PPI网络，同时筛选出关键基因，见图2。图中共涉及25个节点，47条边。度值排名前6的蛋白基因为IL-6、IL-1β、TNF、CCL3、CXCL8和CXCL1，在整个网络中发挥关键作用，可能是痛风发生发展的关键基因，基本信息见表1。

表1 关键基因的基本信息Tab.1 Basic information of key genes

图2 PPI网络Fig.2 PPI network

2.3 GO和KEGG富集分析 GO富集分析关键基因功能的过程中，共确定了915个条目；KEGG富集分析关键基因共得到60条信号通路，根据富集的基因数排序，选取富集基因数最多的10个条目以气泡图的形式展现（P＜0.05），见图3。分析结果显示，痛风发生发展的生物过程主要包括细胞对脂多糖、细菌来源分子及生物刺激的反应；主要涉及IL-17、Toll样受体、NOD样受体、核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）等信号通路。

图3 GO和KEGG富集分析气泡图Fig.3 GO and KEGG enrichment analysis bubble plot

2.4 免疫细胞浸润分布情况 本研究共涉及22种免疫细胞的类型，包括初始B细胞、记忆性B细胞、浆细胞、CD8＋T细胞、初始CD4+T细胞、未活化的CD4+记忆T细胞、活化的CD4+记忆T细胞、滤泡辅助性T细胞、调节性T细胞、γδT细胞、未活化的NK细胞、活化的NK细胞、单核细胞、M0巨噬细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、未活化的树突状细胞、活化的树突状细胞、未活化的肥大细胞、活化的肥大细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞。在R语言中，用barplot包绘制柱状图，可见不同免疫细胞在各个样本中的具体占比情况，见图4。然后用pheatmap包对免疫细胞与样本的矩阵数据绘制热图：未活化的CD4+记忆T细胞、γδT细胞、未活化的NK细胞、未活化肥大细胞在健康对照组中表达相对较高；记忆性B细胞、活化的CD4+记忆T细胞、活化的NK细胞、单核细胞、活化的树突状细胞、活化的肥大细胞、嗜酸性粒细胞在痛风患者中表达相对较高，见图5。

图4 免疫细胞在不同样本中的分布柱状图Fig.4 Histogram of distribution of immune cells in different samples

图5 免疫细胞在不同样本中的表达水平Fig.5 Expression levels of immune cells in different samples

2.5 免疫细胞间的相关性分析 本研究通过分析免疫细胞间的相关性发现，滤泡辅助性T细胞与活化的肥大细胞相关系数最高，为0.91，即在同一样品中滤泡辅助性T细胞与活化的肥大细胞呈正相关。而在同一样品中，未活化的NK细胞与单核细胞相关系数最低，为-0.87，即在同一样品中未活化的NK细胞和单核细胞表达呈负相关，见图6。

图6 免疫细胞间的相关性热图Fig.6 Heat map of correlations between immune cells

2.6 免疫浸润差异分析 运用R语言的vioplot包绘制小提琴图，通过分析痛风患者与健康对照组间免疫浸润细胞差异，发现未活化的NK细胞、未活化的肥大细胞在健康对照中显著表达，而记忆性B细胞、活化的NK细胞、活化的树突状细胞、活化的肥大细胞、嗜酸性粒细胞在痛风患者中显著表达（P＜0.05，图7）。

图7 痛风患者与健康对照组间免疫细胞的对比情况Fig.7 Comparison of immune cells between gout patients and healthy controls group

2.7 PCA 通过对痛风患者与健康对照组中免疫细胞的浸润情况行PCA，发现痛风患者与健康对照组中的免疫细胞的主成分不交叉，区分度较好。该免疫细胞浸润分析能够很好地将痛风患者与健康对照组区分开，见图8。

图8 免疫细胞PCAFig.8 PCA of immune cells

3 讨论

痛风作为一种慢性炎症性疾病，其反复发作的痛风性关节炎严重影响人们的生活质量，且痛风及其并发症风险随年龄的增长而增加。此外，痛风明显增加了肥胖、心血管疾病、慢性肾脏疾病、静脉血栓栓塞等亚健康或疾病风险［5］。目前认为痛风最主要的发病机制是MSU沉积诱发的损伤，并引起炎症反应和免疫功能紊乱［6］。然而，痛风发病的相关分子机制和免疫机制仍有待研究。随着生物信息技术的兴起，该研究使得研究人员能够探测和研究痛风的基因变化［7］。因此本研究从GSE160170芯片中提取数据，并在痛风患者和健康对照组之间鉴定出496个上调和362个下调的基因。PCA结果证实，这些基因可以很好地区分痛风患者与健康对照组。为探寻痛风的关键基因、信号通路与免疫细胞作用机制，筛选了蛋白互作网络中的关键基因，并对其进行富集分析。结果显示IL-6、IL-1β、TNF、CCL3、CXCL8和CXCL1在痛风患者的血清中均上调，主要富集在IL-17、Toll样受体、NOD样受体和NF-κB信号通路上，其生物过程主要涉及细胞对脂多糖、细菌来源分子及生物刺激的反应。

下述将针对关键基因、信号通路与免疫细胞间的关系展开讨论：①炎症因子IL-6、IL-1β、TNF与CD4+T细胞、巨噬细胞：辅助性T细胞（helper T cells，Th）又称为CD4+T细胞，研究发现MSU晶体能够以非抗原依赖的方式直接激活CD4+T细胞，使其表面NF-κB受体活化因子配体（receptor activator of NFκB ligand，RANKL）高表达，并通过与单核巨噬细胞表面的NF-κB受体活化因子（receptor activator of NF-κB，RANK）进行细胞间接触，进而诱导破骨细胞分化，最终产生骨质破坏［8-10］。此外，在MSU晶体诱导的急性痛风性关节炎大鼠中，CD4+T细胞向Th17细胞分化显著增多，而Th17细胞分泌的IL-17不仅能促进破骨细胞分化，还可诱导巨噬细胞产生IL-6、IL-1β和TNF-α等炎症因子加剧痛风的炎症反应［11-14］；②趋化因子CCL3、CXCL8、CXCL1与中性粒细胞、巨噬细胞：CCL3通过与CCR1、CCR4和CCR5等受体结合而在炎症中发挥作用。研究表明，痛风关节滑膜组织中CCL3表达升高并介导中性粒细胞募集［15］。CXCL8编码的蛋白通常为IL-8，主要由单核巨噬细胞和中性粒细胞产生。而MSU晶体会刺激滑膜内皮细胞产生IL-8，进而激活中性粒细胞向炎症部位聚集，加重炎症反应［16］。CXCL1与IL-8的作用相似，主要由受到IL-1β刺激的中性粒细胞和单核巨噬细胞产生，其同样会介导中性粒细胞的募集。而通过运动疗法能够降低MSU晶体对IL-1β、CXCL1的诱导作用［17-18］；③Toll、NOD样受体信号与巨噬细胞：Toll样受体属于模式识别受体，激活前需要形成异源或同源二聚体。研究表明，痛风患者外周血单核细胞表面的TLR2、TLR4识别MSU晶体后会募集IκB激酶（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK）/NF-κB信号，最终诱导 IL-1β等炎症因子的表达［19-20］。巨噬细胞的NOD样受体3（NLR family pyrin domain containing 3，NLRP3）受到MSU晶体激活后会与 caspase-1组成蛋白复合体（NLRP3炎症小体），进而释放IL-1β并引起炎症反应［21-22］。基于所筛选的基因、信号通路与痛风免疫细胞的作用机制分析可见，影响痛风发病机制的关键基因和其调控的生物过程及信号通路均与免疫细胞的介导相关。

为进一步探究痛风免疫细胞间的作用机制，进行免疫细胞间的相关性分析。结果显示，滤泡辅助性T细胞 （T cells follicular helper，Tfh）与活化的肥大细胞呈正相关，未活化的NK细胞和单核细胞表达呈负相关。①HUANG等［23］研究发现，痛风患者外周血中Tfh细胞倾向于Tfh2细胞的极化，且Tfh2/Tfh1细胞比值与痛风衰老呈正相关。DALBETH等［24］通过鉴定痛风患者痛风石的研究发现，肥大细胞大量分布于电晕区和纤维血管区，且表达出大量IL-1β。表明活化的肥大细胞参与痛风石、血管炎症的病变过程。相关细胞功能研究表明Tfh细胞能促进IgE抗体的产生，进而与肥大细胞IgE受体结合，促进肥大细胞释放炎症介质（组胺、前列腺素、IL-1β等）［25］；②NK细胞在痛风患者关节中以扩增式形成，且高尿酸患者经过低嘌呤饮食后能降低血清中NK细胞数量［26］。痛风发作时单核细胞进入炎症组织，并分为成熟的巨噬细胞以提高对MSU晶体的吞噬能力；此外，成熟的巨噬细胞会分泌IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和IL-18（IFN-γ诱导因子）等多种炎症因子介导关节、肾脏等组织的炎症［27］。目前尚缺少痛风病变中NK细胞与单核细胞的共培养研究，但单核细胞分泌的IL-2、IL-18能够刺激NK细胞增殖分化并产生IFN-γ、TNF-α，而IFN-γ、TNF-α又能反向促进单核细胞分化为成熟的巨噬细胞［28-29］。痛风患者血清生物因子的调查研究也支持这一观点，相较于健康人，痛风患者血清中IL-1β、IL-2、IL-18、IFN-γ、TNF-α明显升高［30］。因此，痛风疾病中NK细胞与单核细胞存在相互介导活化作用，反而言之，未活化的NK细胞与单核细胞则具有负相关关系。

免疫浸润差异分析结果显示：活化的肥大细胞、活化的NK细胞、活化的树突状细胞、嗜酸性粒细胞、记忆性B细胞在痛风患者中显著表达。上文已讨论活化的肥大细胞、NK细胞免疫浸润介导高尿酸、痛风性关节炎的发展。树突状细胞是抗原呈递细胞，不依赖于特定细胞表面受体模式而是通过晶体-脂质接触方式与MSU晶体相互作用，当其活化后会释放IL-1β介导炎症反应［31-32］；MSU与嗜酸性粒细胞共培养研究表明，MSU晶体会迅速诱导嗜酸性粒细胞分泌ATP到细胞外环境中，并诱导IL-1β、IL-6、CXCL8、CCL2、CCL3等多种炎症因子或趋化因子表达［33］。而记忆B细胞尚缺少在痛风模型中的实验验证，未来仍待进一步研究。

综上所述，本研究通过生物信息学筛选并论述了痛风中关键基因和相关通路在免疫细胞中的作用机制、痛风免疫细胞的浸润情况以及免疫细胞之间的相关性，可为痛风的基础研究提供理论支持。此外本研究尚存在一定局限性：首先，GEO数据集中有关痛风的样本量较小；其次，痛风疾病中免疫细胞代谢和反应受诸多因素影响，存在风险偏倚。但利用生物信息技术，综合并分析各数据库的相关研究，能够更加系统、全面地预测痛风分子机制与免疫细胞的关联性，并为理解痛风免疫机制及发现新的诊疗靶点提供更全面的视角。