基于Box-Behnken 设计-响应面法和电子眼的栀子姜炙工艺研究

范星晨，祁玉芳，张科卫，汪思晨，戴桂钰，陆兔林，毛春芹

南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023

栀子GardeniaeFructus为茜草科栀子属植物栀子GardeniajasminoidesEllis 的干燥成熟果实，是中国传统的药食同源品种之一[1-2]。其性寒，味苦，具有泻火除烦、凉血解毒、消肿止痛、清热利湿的功效。现代研究表明，栀子中所含的栀子苷、西红花苷等成分具有保肝利胆、抗炎、抗抑郁等作用[3-7]。

有关栀子的炮制最早见于东汉，称为“擘”，即敲击栀子使其裂开[8]。到了宋代，《产宝杂录》首载“姜汁炒焦黄”[9]。姜栀子的炮制方法自此不断改良和完善，姜汁炙法也一直沿用至今。《中国药典》2020年版收载的越鞠保和丸、黄连上清颗粒、导赤丸等14 种成方制剂均以姜栀子组方配伍入药，但历版《中国药典》栀子项下均未收录姜栀子这一饮片。查阅国家及各省市的炮制规范发现，北京、天津、山西、河南、福建、山东、重庆等省市均收录了姜栀子饮片及其炮制方法，但是不同地区姜栀子的炮制方法有所不同，且均缺少细化统一的炮制工艺参数。故有必要对姜栀子的炮制工艺参数进行细化，以使其质量稳定可控，从而保证临床用药安全有效。

本研究采用 Box-Behnken 设计-响应面法（Box-Behnken design-response surface methodology，BBD-RSM）考察姜栀子炮制工艺，以外观性状与内在指标性成分的含量相结合，以此细化姜栀子炮制工艺参数，为中药饮片炮制工艺的规范化研究提供一定的参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；MS-105D 型1/10 万电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多集团；CM-5 型分光测色仪，日本柯尼卡美能达有限公司；KQ-500E 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；H1650-W 型台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；FA1104N 型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；美的C21-RT2170 型匀火电磁炉，广东美的生活电器制造有限公司；JYL-C93T 型榨汁搅拌机，九阳股份有限公司；BO-400Y 型多功能粉碎机，中国永康铂政五金厂；H1650-W 型台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Milli-Q Integral 3 型超纯水器，南京汉隆实验器材有限公司。

1.2 试剂与药品

对照品栀子苷（批号21092708，质量分数99.11%）、西红花苷I（批号20022801，质量分数98.29%）、京尼平龙胆双糖苷（批号21090604，质量分数99.20%）、西红花苷II（批号19102303，质量分数98.84%）均购于成都普菲德生物技术有限公司；甲醇、甲酸、乙腈为色谱纯；实验用水为经Milli-Q Integral 3 型超纯水器处理后所得的超纯水。

16 批栀子药材（编号Z01～Z16）购于8 个不同的省份，分别为浙江金华（Z01）、苍南（Z02），四川成都（Z03），山西晋城（Z04），安徽亳州（Z05）、六安（Z06），江西井冈山（Z07）、九江（Z08）、上饶（Z09）、樟树（Z10），湖北神农架（Z11）、蕲春（Z12），福建三明（Z13）、福安（Z14），湖南岳阳（Z15）、湘潭（Z16）；分别取上述栀子药材按照《中国药典》2020 年版饮片项下制备成相对应的净栀子饮片（ZP01～ZP16）；辅料生姜购于江苏南京。经南京中医药大学陈建伟教授鉴定，分别为茜草科栀子属植物栀子GardeniajasminoidesEllis 的干燥成熟果实、姜科姜属植物姜ZingiberofficinaleRosc.的新鲜根茎。经检测均符合《中国药典》2020 年版的质量要求。

2 方法与结果

2.1 栀子姜炙制备方法

2.1.1 辅料姜汁的制备 取生姜100 g，洗净，捣碎，加水适量榨汁，用4 层纱布滤过。姜渣再加水适量，重复压榨2 次，合并汁液，最后得生姜汁100 mL（每1 mL 生姜汁相当于生姜1 g）。

2.1.2 姜栀子的制备 取100 g 净栀子饮片，加入一定量的姜汁拌匀，润透，置于已设定相应功率的炒制容器内，翻炒至规定程度，取出，晾凉，即得。其中姜汁用量以净栀子饮片质量的百分比表示。如10%的姜汁用量即指100 g 净栀子饮片所用姜汁量为10 g。

2.2 指标成分的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱为Agilent C-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱：0～15 min，96%～88%乙腈；15～30 min，88%～80%乙腈；30～35 min，80%～74%乙腈；35～45 min，74%～60%乙腈；45～60 min，60%～96%乙腈；体积流量1.0 mL/min；检测波长254 nm 和440 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。经上述色谱条件进样检测，样品中栀子苷和西红花苷I 色谱峰的保留时间与对照品的保留时间相一致，均能达到很好的分离效果。对照品及样品的HPLC图见图1。

图1 混合对照品 (254 nm, A; 440 nm, B) 和姜栀子样品(254 nm, C; 440 nm, D) 的HPLC 图Fig.1 HPLC of mixed reference substances (254 nm, A; 440 nm, B) and Gardeniae Fructus processed with ginger juice(254 nm, C; 440 nm, D)

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取对照品京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷I 和西红花苷II适量，配制成质量浓度为1.904、1.816、1.991、1.211 mg/mL 的混合对照品储备液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取按“2.1.2”项下制成的姜栀子饮片，打粉。精密称取其粉末（过四号筛）0.1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，称定质量，超声处理40 min（功率250 W、频率40 kHz），放冷，称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，高速（12 000 r/min）离心（离心半径5 cm）10 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取“2.2.2”项下混合对照品储备液，按倍比稀释原则制备成系列混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，以峰面积平均值（Y）对质量浓度（X）进行线性回归，计算回归方程分别为京尼平龙胆双糖苷Y＝647.030X＋1.517 2，r＝0.999 9，线性范围59.6～952.0 μg/mL；栀子苷Y＝2 843.000X＋2.697 1，r＝0.999 5，线性范围56.8～908.0 μg/mL；西红花苷IY＝2 460.700X－22.152，r＝0.999 4，线性范围62.2～996.0 μg/mL；西红花苷IIY＝1 012.800X－12.951，r＝0.999 6，线性范围75.7～605.5 μg/mL。

2.2.5 精密度试验 精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录各色谱峰峰面积，根据目标化合物峰面积计算其RSD。结果京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷I、西红花苷II 峰面积的RSD 分别为0.66%、0.52%、0.47%、0.67%，结果表明仪器系统精密度良好。

2.2.6 重复性试验 取编号为Z06 的栀子药材，按“2.1.2”项下方法制成姜栀子饮片，精密称取姜栀子样品粉末6 份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，按标准曲线法计算出各目标化合物的含量，并计算得各目标化合物含量的RSD。结果京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷I、西红花苷II 的平均质量分数分别为2.706 8%、8.052 3%、6.095 2%、1.213 8%，其RSD 分别为1.40%、0.22%、0.71%、0.68%，结果表明所建立的试验方法重复性良好。

2.2.7 稳定性试验 取编号为Z06 的栀子药材，按“2.1.2”项下方法制成姜栀子饮片，精密称取同一份样品粉末，按“2.2.3”项下方法制备成供试品溶液，分别在制备后0、2、4、8、12、24 h 按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，根据目标化合物峰面积计算其RSD。结果京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷I、西红花苷II 峰面积RSD 分别为0.80%、0.73%、0.63%、0.92%，结果表明供试品溶液在室温密闭条件下放置24 h 内稳定性良好。

2.2.8 加样回收率试验 取编号为Z06 的栀子药材，按“2.1.2”项下方法制成姜栀子饮片，精密称取0.05 g 已知各指标成分含量的姜栀子粉末9 份，分成3 组，每组分别精密加入0.5、1.0、1.5 mL 的混合对照品溶液（其中1.0 mL 混合对照品溶液中指标成分质量浓度与样品中指标成分质量浓度总体相当），按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算各目标化合物的加样回收率及其RSD。结果京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷I、西红花苷II 的平均加样回收率分别为100.12%、100.09%、99.99%、100.21%，RSD 分别为1.20%、0.90%、0.80%、1.30%，结果表明该试验所建立的含量测定方法准确度良好。

2.3 姜栀子炮制工艺考察

2.3.1 BBD-RSM 试验设计 根据本课题组前期研究情况[10]，选择炒制火力（X1）、炒制时间（X2）、姜汁用量（X3）3 个因素设计响应面试验，Y为综合评分。炮制工艺评价选择栀子苷、西红花苷I、醇溶性浸出物的含量及外观性状（颜色＋气味）作为指标。BBD-RSM 试验设计与结果见表1，外观性状评分标准见表2。

表1 BBD-RSM 试验设计与结果Table 1 Design and results of BBD-RSM

表2 姜栀子外观性状评分Table 2 Evaluation of appearance of Gardeniae Fructus processed with ginger juice

按照Box-Behnken 试验设计原理进行试验设计，根据各指标重要程度确定综合评分的方法，具体计算方法见如下公式。

i表示组别编号，S1i、S2i、S3i分别对应各组别姜栀子饮片栀子苷含量、西红花苷I 含量、醇溶性浸出物含量，S1max、S2max、S3max分别对应所有组别姜栀子饮片栀子苷含量、西红花苷I含量、醇溶性浸出物含量的最大值，Pi为各组别姜栀子饮片性状评分（颜色＋气味）（分），Pmax为所有组别姜栀子饮片性状评分最大值（分）

2.3.2 栀子姜炙外观性状研究

（1）色泽评价：根据响应面法设计的试验分组进行测色试验，按“2.1”项下方法制备姜栀子饮片并粉碎过三号筛，备用。测色仪测定光源D65，视角测量口径φ3 mm，测定试场10°，测量波长360～740 nm，测量波长间隔10 nm，照明光源脉冲氙灯，SCE 模式（不包含镜面反射光），30 mm。零校正（放置透明片、黑筒）与用户校正（放置透明片、白板）。将4.0 g 样品粉末均匀平铺在测试皿内采集图像并记录色度值，平行测定3 次取平均值。

以明度值（L*）、红绿值（a*）和黄蓝值（b*）来表示色号并计算总色度值（Eab*），公式为Eab*＝(L*2＋a*2＋b*2)1/2，Eab*越大颜色越浅[11]。其中L*由0～100 表示颜色由黑到白；a*由正到负表示颜色由红到绿色；b*由正到负表示颜色由黄到蓝[12-13]。可用总色差值（ΔEab*）[11]表示2 个色号之间的色差，计算公式为ΔEab*＝(ΔL*2＋Δa*2＋Δb*2)1/2，规定当ΔEab*＞1.5 时，表示待测样品颜色间有明显差异[14]。颜色评分范围见表3，不同炮制程度姜栀子饮片见图2。由表3 可知，评分4 的总体亮度最高，颜色最浅，总体偏红偏黄，符合主体红黄色的外观性状描述；相比评分4，评分5 的姜栀子亮度、红色度、黄色度均较小，故呈现金黄色的外观；评分3、2、1 的姜栀子亮度、红色度、黄色度随着评分降低其下降幅度很大，其亮度逐渐变暗，颜色也逐渐加深，与肉眼所见的主观感受相符合。取各个评分L*、a*、b*的平均值代入ΔEab*的计算公式，各个评分之间的ΔEab*按照评分顺序从高到低分别为3.657、5.207、8.678、7.533 均远大于规定所述的1.5，说明不同评分的姜栀子饮片颜色有明显差异，故采用电子眼测色评价姜栀子的炮制程度是可行的。

表3 姜栀子颜色评分范围Table 3 Color rating range of Gardeniae Fructus processed with ginger juice

图2 不同炮制程度姜栀子饮片Fig.2 Different processing degrees of Gardeniae Fructus processed with ginger juice

（2）气味评价：随机选取15 名嗅觉正常的健康人员对炮制后的姜栀子饮片进行气味测评，取其平均值作为气味评分（评分标准见表2）。气味评分结果见表1。

2.3.3 BBD-RSM 试验结果 按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，按照标准曲线法计算，得出栀子苷、西红花苷I 的含量；浸出物测定按照《中国药典》2020 年版测定方法（通则2201），采用热浸法提取醇溶性浸出物，提取溶剂为乙醇。结果见表1。

利用Design-Expert 10.0 软件处理实验数据，对各因素分别进行多元线性回归和二项拟合，得到回归方程Y＝−201.590 8＋0.652 9X1＋24.569 9X2＋24.661 8X3＋0.006 5X1X2－0.006 1X1X3－0.081 1X2X3－0.000 8X12－2.933 7X22－1.139 5X32，判定系数（R）0.982 0。回归模型具体数据见表4，本次建立的模型P＜0.001，F值为42.441 4，表明此响应回归模型达到了极显著性水平，具有统计学意义，且失拟项P值为0.095 6＞0.05，F值为4.321 9，失拟项不显著，表明无失拟因素存在。因此，该回归方程可对实验结果进行分析。根据模型的判定系数（R2＝0.982 0）、调整判定系数（Radj2＝0.958 9）和预测判定系数（Rpre2＝0.943 3），可知有4.11%的变异不能用该模型解释，说明该模型拟合性较好；变异系数（CV）2.58%＜10%表明试验精确度可信度高。精密度是有效信号与噪声的比值，为19.099 5＞4，说明试验较为合理。

表4 Box-Behnken 回归模型方差与显著性分析Table 4 Analysis of variance and significance of Box-Behnken regression model

拟合模型中各系数的绝对值大小直接反映各因素对指标值的影响程度，X1、X2、X3、X12、X22、X32项P值具有统计学意义（均＜0.05），对综合评分均有影响。其中单因素项的X1（炒制火力）和X2（炒制时间）对模型的影响表现出极显著性水平（P＜0.001），对综合评分影响较大，表明这2 项是影响姜栀子饮片质量的主要因素。X3（姜汁用量）虽然不是影响姜栀子饮片质量的主要因素，但仍表现出显著性水平（P＜0.05）。根据F值大小得3 个因素对姜栀子炮制品质量影响的贡献率为X2＞X1＞X3。

根据拟合回归方程，运用Origin 2018 软件建立矩阵并绘制三维效应面图和等高线图，结果见图3。右侧各影响因素两两交互的等高线均呈现椭圆形，说明各因素交互作用较为显著。结合左侧三维效应面图可知，炒制火力（X1）、炒制时间（X2）的三维图倾斜度较高，坡度较陡，颜色加深变化显著，说明这2 个因素对姜栀子炮制工艺综合评分影响较为显著，该结论与方差分析结果一致。

图3 炒制温度 (X1)、炒制时间 (X2)、姜汁用量 (X3) 3 因素对综合评分的三维效应面图和等高线图Fig.3 Response and contour surface plots of processing firepower (X1), frying time (X2) and the amount of ginger juice (X3)three factors to composite score

利用软件进行数据预测可知，姜栀子的最优炮制工艺为炒制火力368.543 W，炒制时间4.459 min，姜汁用量9.677%，综合评分为92.805 分。结合实际操作，将最佳工艺修正为炒制火力400 W，炒制时间4.5 min，姜汁用量10%。

2.4 姜炙工艺验证试验

按照上述优化工艺制备3 份样品，样品表面呈金黄色，具姜辣味。具体评分结果见表5，结果表明本研究优选出的姜栀子炮制工艺稳定可行。

表5 验证试验结果Table 5 Results of verification test

2.5 栀子姜炙前后化学成分变化

取“1.2”项下的净栀子饮片（ZP01～ZP16）；按照优选工艺制备姜栀子饮片（JZP01～JZP16），按“2.2”项下方法进行测定，计算各成分含量，实验结果见表6。栀子饮片经姜炙后其中的京尼平龙胆双糖苷、栀子苷的含量均有上升；西红花苷I、II的含量显著降低，尤以西红花苷II 含量下降最为显著，平均下降幅度约为46%。

表6 16 批栀子饮片和姜栀子饮片样品中4 种成分含量测定 (n = 3)Table 6 Contents of four compounds in Gardeniae Fructus samples (n = 3)

3 讨论

目前，针对姜栀子的研究较少且研究内容基本都以单个成分含量检测为主，缺少其他的代表性成分。本研究引入电子眼测色这一技术，将外观评价的色泽进行量化，减少了主观因素带来的评判失误，这样就能更加科学合理地对姜栀子饮片的炮制程度进行客观评判。

本研究发现栀子在姜炙过程中其外观性状与内在化学成分均发生了变化。栀子在姜炙不及时呈现原本的红黄色，在姜炙得当后呈现金黄色，在姜炙太过时颜色逐渐呈棕褐色；栀子经姜炙后，其中所含的栀子苷与京尼平龙胆双糖苷的含量均有上升，该结果与其他学者的研究相一致[10,15]；西红花苷I、II 的含量显著降低，尤以西红花苷II 下降最为显著，可能与其作为长链结构的化合物性质不稳定，较易转化为其他物质有关[16-17]。

在进行气味评价试验时，本实验参考姜炙工艺的相关文献报道[18-20]，发现目前尚未见测试气味时所采用的测试人员的相关信息（健康状况、人数）。为了使得气味评分结果更具客观性，本实验选择15名具有正常嗅觉的健康人员进行测试评分，然后取平均值的方法来获得最终的气味测试结果，从而保证气味评价数据的合理性。

本实验将颜色变化以客观量化方式纳入考察范畴，使得试验结果更加科学、准确、客观。在考察指标方面选用了栀子中的栀子苷、西红花苷等具有生理活性的物质作为评价指标，相比于单一化学成分的考察更加合理，且这些指标成分在实际测定过程中耗费的资源成本较低，符合企业大规模生产的要求。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突