基于UPLC-Q-TOF-MS/MS 的疏肝和胃汤化学成分、HPLC 指纹图谱、化学模式识别及含量测定研究

袁传裕，胡俊杰，李 娟，刘焱文，刘松林，陈 新

湖北中医药大学 中药资源与中药化学湖北省重点实验室，湖北 武汉 430065

疏肝和胃汤（Shugan Hewei Decoction，SHD）是国医大师梅国强教授在经典名方四逆散的基础上加味而成，由柴胡、白芍、甘草、枳实、木香、郁金、吴茱萸、白术、黄连、砂仁10 味药组成；具有疏肝解郁、调达肝气、行气散结、除痞导滞、养血滋肝、柔肝止痛、解胃脘气滞、痞胀不舒的功效，全方疏肝理气、健脾和胃，主要用于治疗“肝郁气滞”所致的抑郁症[1]。本课题组前期研究发现，SHD能够调节抑郁大鼠下丘脑-垂体- 肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）轴功能，提高脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、N-甲基-D-天冬氨酸受体1（Nmethyl-D-aspartate receptor，NMDAR1）蛋白表达水平，保护神经元；也可改善肝脏病理状态，调节大鼠氨基酸代谢、能量代谢和甘油磷脂代谢以减轻抑郁症状[2-3]。基于文献考证和课题组前期研究，SHD全方药材数量较多，成分较复杂；其主要成分尚不清楚，进而影响到与其质量控制相关的含量测定。液质联用技术具有高效、高分辨率、高选择性、高灵敏度等优点，已广泛应用于中药复方的化学成分分析[4-5]。指纹图谱技术在中药质量评价、真伪鉴别等领域应用广泛[6-7]。本研究基于UPLC-Q-TOFMS/MS 技术，对该方中化学成分进行定性鉴别，同时利用HPLC 建立了SHD 的指纹图谱，并结合3种化学模式识别进行多维度质量评价，且对其中9个成分的含量进行测定，为SHD 后期深入研究以及新药开发提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1290 Infinity II 液相色谱系统、6540 四级杆-飞行时间（Q-TOF）液质联用系统、MassHunter Acquisition 色谱工作站、1260 液相色谱系统，美国Agilent 公司；Heal Force Smart 超纯水系统，武汉力康生物医疗科技有限公司；MS105DU 型电子天平，上海梅特勒托利多仪器有限公司；YS0203 型超声波清洗机，深圳云奕科技股份有限公司。

1.2 材料

对照品芍药苷（批号M28GB143089，质量分数≥98%）、柠檬苦素（批号H23J9K65962，质量分数≥98%）、白术内酯II（批号J18HB173939，质量分数≥98%）、甘草苷（批号Z10J8X39611，质量分数≥98%）、槲皮苷（批号J12H13186308，质量分数≥98%）、橙皮苷（批号K09S11L123847，质量分数≥98%）、小檗碱（批号S01A10K94340，质量分数≥98%）、柚皮素（批号L21O10Q100513，质量分数≥98%）、木香烃内酯（批号J22GB152186，质量分数≥98%），均购自上海源叶生物科技有限公司；用于质谱的甲醇、乙腈购自德国默克公司；甲酸购自美国迈瑞达公司；用于HPLC 的甲醇、乙腈购自德国默克公司；其他试剂为分析纯。

1.3 药材

10 种饮片均由湖北中医药大学李娟教授鉴定为正品。柴胡为伞形科柴胡属植物柴胡Bupleurum chinenseDC.的干燥根（批号202301006、230202201，产地河北；批号C089221202，产地山西）；甘草为豆科甘草属植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根茎（批号230201、C201230101，产地新疆；批号202301018、202302021，产地内蒙古）；白芍为毛茛科芍药属植物芍药PaeonialactifloraPall.的干燥根（批号230201、202302009、C035220602，产地安徽）；木香为菊科川木香属植物木香Aucklandia lappaDecne.的干燥根（批号2322050101、202111001、230201、220401，产地云南）；枳实为芸香科柑橘属植物酸橙CitrusaurantiumL.的干燥幼果（批号2322120127、2222040206，产地湖北）；吴茱萸为芸香科吴茱萸属植物吴茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.的干燥近成熟果实（批号202301004、230101、C554221201，产地江西）；白术为菊科苍术属植物白术AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根茎（批号C039230201，产地安徽；批号202306012、202303027，产地浙江）；郁金为姜科姜黄属植物温郁金CurcumawenyujinY.H.Chen et C.Ling 的干燥块根（批号202112010、202206008、220800181，产地广西；批号230101，产地四川）；砂仁为姜科豆蔻属植物阳春砂AmomumvillosumLour.的干燥成熟果实（批号221103321、202210027，产地广东；批号202111011，产地云南）；黄连为毛茛科黄连属植物黄连CoptischinensisFranch.的干燥根茎（批号C806221101、221201451、C806221101，产地四川）。SHD 的各个药材组合见表1。

表1 SHD 的药材组合Table 1 Combination of SHD medicinal materials

2 方法

2.1 色谱条件

2.1.1 成分鉴定 色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈；梯度洗脱：0～5 min，5%乙腈；5～15 min，5%～35%乙腈；15～18 min，35%～45%乙腈；18～22 min，45%～55%乙腈；22～27 min，55%～95%乙腈；27～32 min，95%乙腈；32.1～37 min，95%～5%乙腈；体积流量为0.2 mL/min；柱温为40 ℃；进样量为2 μL。

2.1.2 指纹图谱及含量测定 色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.1%磷酸水溶液-乙腈；梯度洗脱为0～15 min，5.0%～12.7%乙腈；15～18 min，12.7%～12.8%乙腈；18～22 min，12.8%～16.0%乙腈；22～23.3 min，16.0%～16.1%乙腈；23.3～25.5 min，16.1%～16.3%乙腈；25.5～33 min，16.3%乙腈；33～55 min，16.3%～17.9%乙腈；55～70 min，17.9%～26.0%乙腈；70～72 min，26.0%～31.0%乙腈；72～78 min，31.0%～33.0%乙腈；78～80 min，33.0%～35.0%乙腈；80～83 min，35.0%～45.0%乙腈；83～87 min，45.0%乙腈；87～100 min，45.0%～47.0%乙腈；100～108 min，47.0%～57.0%乙腈；108～113 min，57.0%～70.0%乙腈；113～116 min，70.0%～75.0%乙腈；116～120 min，75.0%～95.0%乙腈；120～125 min，95.0%乙腈；125～125.01 min，95.0%～5.0%乙腈；125.01～130 min，5.0%乙腈；体积流量为1.0 mL/min；变波长检测：0～27 min，225 nm；27～76 min；210 nm；76～82 min，287 nm；82～130 min，210 nm；柱温为25 ℃；进样量为10 μL。

2.2 质谱条件

离子源为电喷雾离子源（ESI）；采集模式为正、负离子模式；质量扫描范围m/z50～1 500；去溶剂气流温度320 ℃；去溶剂气流体积流量8 L/min；鞘气温度280 ℃；鞘气体积流量11 L/min；喷雾器压力275.79 kPa（40 psi）；毛细管电压4 000 V（负离子模式3 500 V）；喷嘴电压1 000 V（负离子模式1 500 V）；碎裂电压150 V。

2.3 对照品溶液的制备

2.3.1 成分鉴定 称取芍药苷、柴胡皂苷A、甘草苷、槲皮苷、橙皮苷、甘草次酸、小檗碱、柚皮素、柠檬苦素、白术内酯II、木香烃内酯对照品适量，加甲醇制成质量浓度约1 mg/mL 的对照品溶液。

2.3.2 指纹图谱及含量测定 精密称定芍药苷、甘草苷、槲皮苷、橙皮苷、小檗碱、柚皮素、柠檬苦素、白术内酯II、木香烃内酯对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为3 058.00、2 666.00、290.30、348.20、1 330.00、304.00、642.00、118.40、4.69 μg/mL的对照品储备液。

2.4 供试品溶液的制备

2.4.1 成分鉴定 取柴胡10 g、白芍10 g、炙甘草6 g、麸炒枳实10 g、郁金10 g、木香10 g、麸炒白术15 g、砂仁10 g、吴茱萸6 g、黄连6 g，置于圆底烧瓶中，加入10 倍药材质量的纯化水，回流提取4 h 后，纱布滤过，取清液，浓缩至约400 mL，冷冻干燥，得到SHD 冻干粉（收率49.3%），称取12 mg，用50%甲醇定容至5 mL，超声（500 W、240 kHz）15 min 后过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

2.4.2 指纹图谱及含量测定 按“2.4.1”项下处方比例称取SHD 全方置于圆底烧瓶中，加入10 倍药材质量的纯化水，回流提取4 h 后，纱布滤过，取清液，冷却至室温后精密吸取5 mL，置于100 ℃水浴锅上挥干溶剂，残渣加50%甲醇水溶液复溶，定容至10 mL，超声（500 W、240 kHz）15 min，过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

3 结果

3.1 SHD 中化合物的指认与鉴定

取对照品溶液、供试品溶液，按“2.1.1”项下的色谱条件与“2.2”项下的质谱参数进行测定，所得一级正、负离子模式下的基准峰强度（base peak intensity，BPI）图见图1。通过分析一级所得的化合物分子离子与二级模式下的碎片离子峰，比较已有对照品与样品的保留时间并参考相关文献，从SHD 中鉴定出88 种成分，包括26 个黄酮类成分、27 个萜类成分、18 个生物碱类成分、6 个香豆素类成分、6 个有机酸类成分、2 个苯丙素类化合物、4个其他类成分。其中4 个来自柴胡，4 个来自白芍，16 个来自甘草，21 个来自枳实，13 个来自黄连，7个来自白术，1 个来自砂仁，4 个来自郁金，14 个来自吴茱萸，7 个来自木香。结果见表2。

表2 SHD 的UPLC-Q-TOF-MS/MS 定性分析结果Table 2 UPLC-Q-TOF-MS/MS qualitative analysis results of SHD

3.1.1 黄酮类化合物 黄酮类化合物是以2-苯基色原酮为基本母核的一类多酚化合物，多以糖苷的形式存在于植物体内。其基本碳架结构为C6-C3-C6[21]。根据B 环的取代位置和C 环C-2 和C-3 位的还原情况可将黄酮分为黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮、二氢异黄酮、查耳酮、二氢查尔酮、花色素等[22]。

从SHD 共鉴定出黄酮类化合物26 个，按其结构类型可分为黄酮11 个、黄酮醇4 个、二氢黄酮8个、异黄酮3 个、黄烷酮1 个。根据黄酮C 环和A环上的取代基差异可将黄酮简单地分为羟基取代黄酮、甲氧基取代黄酮、黄酮苷等。相似的，黄酮类化合物会出现丢失C-4 位羰基，即M－CO，C 环形成呋喃环；也可同时丢失C-1 位O 和C-4 位羰基，即M－CO2，C 环形成四元烯烃环。还可发生逆迪尔斯-阿尔德（retro Diels-Alder，RDA）重排，C 环1、2 位与3、4 位断开，C 环上的2、3 位形成中性分子并连同B 环丢失，C 环1 位O 与4 位羰基相连，生成四元丙内酯环。羟基取代黄酮在分子结构中含有邻二羟基时可发生脱水重排，即M－H2O，但在一些黄酮苷类化合物中，由于糖基上与黄酮苷元的双羟基在空间上临近，也可发生脱水重排；甲氧基取代黄酮由于O 元素的强电负性，易发生MCH3·的异裂[23-24]。以黄酮类成分橘皮素为例，正离子模式出现分子离子峰m/z373 [M＋H]+，其特征碎片离子m/z358 [M＋H－CH3]+、345 [M＋H－CO]+、343 [M＋H－2CH3]+、329 [M＋H－CO2]+、211 [M＋H－2CH3－C9H8O]+、183 [M＋H－2CH3－C9H8OC2H4]+。通过比对数据库及文献报道[25]，证实该化合物为橘皮素，推测裂解途径见图2。

图2 桔皮素裂解途径预测Fig.2 Prediction of cleavage pattern of tangeretin

3.1.2 生物碱类化合物 生物碱类化合物的特点是结构中至少有1 个碱性N 原子[26]。按结构可分为有机胺类，如麻黄碱；异喹啉类，如小檗碱；喹唑啉类，如吴茱萸碱；吲哚类，如长春新碱等[27]。SHD共鉴定出生物碱类化合物18 个，多数存在于黄连和吴茱萸中，按其结构类型可分为有机胺类1 个；异喹啉类13 个；喹唑啉类2 个；吲哚类1 个。异喹啉生物碱的基本结构为异喹啉环通过1 个饱和六元环与苯环相连。

按异喹啉环上取代基的差异分为多种类型；当异喹啉有甲氧基取代时，易发生β 异裂，失去-CH3后分子结构重排形成羰基，后发生RDA 重排丢失1分子羰基，也可以再失去1 分子-CH3，继而发生RDA 重排[28]。喹唑啉生物碱基本结构为喹唑啉环与一吲哚环通过饱和六元环相连；从SHD 鉴定到的2种喹唑啉化合物吴茱萸碱与吴茱萸次碱的喹唑啉基团的4 位均有羰基，可发生RDA 重排，丢失1 分子羰基，进而生成苯丙咪唑环，并在此基础上发生重排反应，丢失1 分子HCN，并生成4 元氮杂环；此反应可重复发生2 次，即发生2 次重排，丢失2分子HCN[29]。以异喹啉类生物碱黄藤素为例，正离子模式可见分子离子峰m/z352 [M]+，其特征碎片离子m/z337 [M－CH3]+、336 [M－CH3－H]+、322[M－2CH3]+、308 [M－CH3－H－CO]+、294 [M－2CH3－CO]+。经文献报道[30]比对，确定该化合物是黄藤素。裂解途径见图3。

图3 黄藤素裂解途径预测Fig.3 Prediction of cleavage pattern of palmatine

3.1.3 萜类化合物 萜类化合物是以异戊二烯（C5）为基本单元组成的一类化合物，按异戊二烯单元的数目可分为单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜、多萜。从SHD 共鉴定出萜类化合物26 个，包括单萜类2 个，如芍药苷、芍药内酯C；倍半萜类11 个，如白术内酯I、珊塔玛内酯等；三萜类13 个，如甘草次酸、柠檬苦素等。倍半萜类化合物含有3 个异戊二烯单元，其分子结构多含有羰基和羟基；在其分子内含有羟基时，一般可发生邻位脱水，即M－18，并形成1 个双键；由于倍半萜结构中存在多数饱和C 原子，这一反应通常可以推测该倍半萜所含的羟基数目，即发生几次脱水反应。含有羰基的倍半萜化合物可发生重排反应，脱去羰基，即M－28。由于上述反正的进行，双键的存在可使与其相连的甲基发生重排裂解，甲基上的1 个H 原子转移到双键上，单键断裂，即M－14。分子中如果有γH 和双键同时存在时，可以发生麦氏重排，丢失1 分子C2H4，即M－26[31]。以倍半萜类化合物白术内酯III 为例，正离子模式可见分子离子峰m/z249 [M＋H]+，其特征碎片离子m/z231 [M＋H－H2O]+、203 [M＋H－H2O－CO]+、189 [M＋HH2O－C3H6]+、175 [M＋H－H2O－C3H6－CH2]+、163[M＋H－H2O－C5H8]+。根据文献报道[32]比对，确定该化合物为白术内酯III，裂解途径见图4。

图4 白术内酯III 裂解途径预测Fig.4 Prediction of cleavage pattern of atractylenolide III

三萜类化合物含有6 个异戊二烯单元，其一般多与各种单糖或二糖相连，其相对分子质量大，结构复杂。与糖苷相连的三萜类化合物通常会丢失分子内的糖苷，此反应可以1 次丢失1 分子的单糖，也可将所连接的糖苷全部脱去；甘草酸可见上述反应。未与糖苷结合的三萜类化合物多发生重排反应，可丢失的较常见的中性碎片有H2O、CO、CO2等[33]。以三萜类化合物甘草酸为例，正离子模式可见分子离子峰m/z823 [M＋H]+，其特征碎片离子m/z647[M＋H－C6H8O6]+、471 [M＋H－2C6H8O6]+、453[M＋H－2C6H8O6－H2O]+、435 [M＋H－2C6H8O6－2H2O]+、407 [M＋H－2C6H8O6－H2O－C2H4]+。根据与文献比对[34-35]，确定该化合物为甘草酸，裂解途径见图5。

图5 甘草酸裂解途径预测Fig.5 Prediction of cleavage pattern of glycyrrhizin

3.2 SHD 指纹图谱研究

3.2.1 精密度试验 取同一批SHD 样品（S5）1 份，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.2”项下色谱条件进样测定6 次，以3 号峰槲皮苷为参照峰（S），计算得各共有峰相对保留时间的RSD为0.02%～0.21%，相对峰面积的RSD 为0.14%～2.32%，表明该方法精密度良好。

3.2.2 重复性试验 取同一批SHD 样品（S5）6 份，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.2”项下色谱条件进样测定，以8 号峰槲皮苷为参照峰（S），计算得到各共有峰相对保留时间的RSD 为0.05%～0.67%，相对峰面积的RSD 为0.47%～3.36%，表明该方法重复性良好。

3.2.3 稳定性试验 取SHD（S5）供试品溶液，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.2”项下色谱条件进样测定，于0、4、8、12、16、20、24 h进样测定，以8 号峰槲皮苷为参照峰（S），计算得到各共有峰相对保留时间的RSD为0.04%～0.67%，相对峰面积的RSD 为0.23%～3.86%，表明SHD 供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

3.2.4 指纹图谱的建立及其相似度评价 取10 批SHD 样品溶液，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.2”项下色谱条件进样测定，数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012）版”，以S1 号样品色谱图为参照图谱，采用中位数法，时间窗设为0.1 min，通过多点校正进行Marker 峰匹配，建立叠加图谱及对照图谱，结果见图6，确定20 个共有峰，其中2 号峰为芍药苷、4 号峰为甘草苷、8 号峰为槲皮苷、9 号峰为橙皮苷、12 号峰为小檗碱、13 号峰为柚皮素、14 号峰为柠檬苦素、19 号峰为木香烃内酯、20 号峰为白术内酯II。各样品之间的相似度在0.958～1.000，结果见表3，表明10 批SHD 样品存在一定差异。

图6 10 批SHD 叠加谱图及对照指纹谱图 (R)Fig.6 Superimposed spectra of 10 batches of SHD and control fingerprint spectra (R)

表3 10 批SHD 指纹图谱相似度Table 3 Similarity of fingerprints of 10 batches of SHD

3.3 化学模式识别分析

3.3.1 层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA） 将10 批SHD 的20 个共有峰峰面积导入SPSS 27.0 软件，采用组间联接的聚类方法，以平方欧氏距离为样品间距离进行HCA，当平方欧式距离为25 时。SHD 样品聚为2 类，样品S2、S4、S8、S10 聚为一类，其余样品聚为另一类，见图7。

图7 10 批SHD 的HCA 树状图Fig.7 Tree diagram of HCA for 10 batches of SHD

3.3.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 将10 批SHD 样品的20 个共有峰峰面积导入SPSS 27.0 软件，对20 个峰面积进行标准化处理后进行PCA，结果见表4。前6 个因素的累积方差贡献率＞85%，且特征值＞1，可以概括SHD 样品的大部分信息。

使用SPSS 27.0 软件对10 批SHD 样品共有峰峰面积标准化处理后的数据为变量，运用SIMCA 14.1 软件得到10 批SHD 样品PCA 得分图见图8。结果所有样品均在95%的置信区间内分为2 类，其中样品S2、S4、S8、S10 聚为一类，其余样品聚为另一类，与HCA 结果一致。

图8 10 批SHD 的PCA 得分图Fig.8 PCA score chart of 10 batches of SHD

3.3.3 正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）使用SPSS 27.0 软件对10 批疏肝和胃汤SHD 样品共有峰峰面积标准化处理，将标准化后的数据导入SIMCA 14.1，通过该软件对10 批疏肝和胃汤SHD样品进行OPLS-DA。使用有监督模式识别方法进行建模。该模型RX2＝0.824，RY2＝1.000，Q2＝0.931，模型预测参数均大于0.5，说明该模型稳定可靠，有较好的预测能力[36]。OPLS-DA 得分图见图9。以变量重要性投影（variable importance projection，VIP）大于1 为标准筛选差异性成分，共筛选出8 个对分类影响较大的成分，分别为峰8、13、6、11、10、12、16、15，见图10。

图9 10 批SHD 的OPLS-DA 得分图Fig.9 OPLS-DA scores chart of 10 batches of SHD

图10 20 个共有峰的VIP 值Fig.10 VIP value chart of 20 common peaks

3.4 含量测定

3.4.1 线性关系考察 取各对照品储备液适量，用甲醇稀释，按“2.1.2”项下色谱条件进样测定，以对照品溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，进行线性回归，得线性回归方程分别为芍药苷Y＝16 672.0X＋37.111，R2＝0.999 8，线性范围50.10～175.40 μg/mL；甘草苷Y＝32 402.0X＋9.193，R2＝0.999 3，线性范围14.93～57.59 μg/mL；槲皮苷Y＝44 407.0X－534.610，R2＝0.999 7，线性范围193.54～647.94 μg/mL；橙皮苷Y＝30 318.0X＋32.836，R2＝0.999 0，线性范围17.43～61.03 μg/mL；小檗碱Y＝28 874.0X－34.934，R2＝0.999 6，线性范围33.77～116.81 μg/mL；柚皮素Y＝20 953.0X－0.190 1，R2＝0.999 2，线性范围0.92～15.20 μg/mL；柠檬苦素Y＝5 786.7X－0.421 9，R2＝0.999 3，线性范围3.24～25.92 μg/mL；木香烃内酯Y＝19 829.0X＋1.698 3，R2＝0.999 2，线性范围1.07～4.11 μg/mL；白术内酯IIY＝36 843.0X－25.565，R2＝0.999 7，线性范围4.33～22.14 μg/mL。

3.4.2 专属性试验 取SHD 样品溶液、混合对照品溶液、50%甲醇溶液及各药材阴性溶液，按“2.1.2”项下色谱条件进样测定，结果表明供试品溶液与对照品溶液保留时间相同位置的色谱峰与各对照品一致，阴性无干扰，其中峰2 为芍药苷、峰4 为甘草苷、峰8 为槲皮苷、峰9 为橙皮苷、峰12 为小檗碱、峰13 为柚皮素、峰14 为柠檬苦素、峰19 为木香烃内酯、峰20 为白术内酯II，色谱图见图11。

图11 SHD 样品溶液、混合对照品溶液、50%甲醇溶液及各药材阴性样品色谱图Fig.11 Chromatograms of sample solution of SHD, mixed reference substances solution, 50% methanol solution and negative samples of medicinal materials

3.4.3 精密度试验 取SHD 样品（S5），按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.2”项下色谱条件进样测定6 次，测定并计算色谱峰峰面积RSD。各成分峰面积的RSD 分别为0.34%、2.31%、0.13%、0.14%、1.37%、0.63%、0.61%、1.88%、0.86%。表明仪器精密度良好。

3.4.4 重复性试验 取同一批SHD 样品（S5），按“2.4.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.1.2”项下色谱条件进样测定，测定并计算色谱峰峰面积RSD。各成分峰面积的RSD 分别为1.08%、2.61%、0.43%、0.43%、1.31%、0.50%、1.31%、1.45%、1.46%。表明该方法重复性良好。

3.4.5 稳定性试验 取SHD 样品（S5），按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，于室温放置0、4、8、12、16、20、24 h 后按“2.1.2”项下色谱条件进样测定，计算色谱峰峰面积RSD。各成分峰面积的RSD 分别为3.40%、1.18%、0.40%、0.73%、3.42%、2.84%、1.51%、2.47%、0.97%。表明该方法所得供试品在24 h 内稳定。

3.4.6 加样回收率试验 取已测定各指标成分含量的SHD 样品（S5）6 份，精密量取5 mL，分别加入相当于S5 样品中各指标成分80%、100%、120%的各对照品，按“2.4.2”项下制备供试品溶液，按“2.1.2”项下色谱条件进样测定，计算得到芍药苷、甘草苷、槲皮苷、橙皮苷、小檗碱、柚皮素、柠檬苦素、木香烃内酯、白术内酯II 的平均回收率为100.51%、96.80%、103.52%、101.16%、101.77%、103.60%、100.43%、99.02%、99.75%，RSD 分别为2.91%、4.39%、3.70%、2.70%、3.64%、1.86%、2.71%、3.78%、1.96%，表明该方法准确度良好。

3.4.7 多指标成分含量测定 取10 批SHD 样品，按“2.4.2”项下方法平行制备3 份供试品溶液，按“2.1.2”项下色谱条件进样测定，外标法计算含量，结果见表5。

表5 10 批SHD 含量测定结果 (±s, n = 3)Table 5 Content determination of 10 batches of SHD (±s, n = 3)

表5 10 批SHD 含量测定结果 (±s, n = 3)Table 5 Content determination of 10 batches of SHD (±s, n = 3)

样品 质量浓度/(μg∙mL−1)芍药苷 甘草苷 槲皮苷 橙皮苷 小檗碱 柚皮素 柠檬苦素 木香烃内酯 白术内酯II S1 98.23±0.75 23.42±0.57 430.01±4.35 28.54±0.43 64.02±1.73 10.66±0.23 8.64±0.21 2.10±0.12 7.13±0.28 S2 96.83±2.15 31.72±1.79 289.44±10.17 37.61±1.86 74.62±1.25 6.45±0.08 8.10±0.38 2.96±0.04 8.17±0.31 S3 95.71±1.69 27.71±1.37 373.99±13.29 29.47±1.66 55.11±1.07 8.90±0.13 5.33±0.04 1.28±0.04 5.75±0.26 S4 89.06±1.79 28.48±0.40 317.07±2.52 25.37±0.97 63.29±2.54 5.53±0.22 5.66±0.16 1.98±0.04 4.99±0.03 S5 88.78±3.07 24.72±0.33 380.79±3.51 36.38±1.07 61.02±0.71 10.56±0.74 7.69±0.17 2.25±0.01 7.14±0.38 S6 94.29±0.44 30.05±0.67 415.43±5.40 36.56±1.42 57.27±1.48 10.60±0.44 20.07±0.59 1.30±0.06 5.54±0.18 S7 94.03±1.64 26.54±0.29 427.52±1.80 27.28±0.85 67.39±1.74 11.16±0.31 5.23±0.16 3.07±0.05 10.06±0.07 S8 97.15±1.15 25.41±0.87 325.29±6.43 45.53±0.95 68.42±2.90 7.30±0.09 5.69±0.22 1.08±0.01 6.05±0.22 S9 92.75±0.51 32.45±0.18 396.58±1.69 30.15±0.95 62.21±0.73 10.77±0.04 20.78±0.18 1.48±0.06 5.51±0.28 S10 90.50±1.33 31.70±1.47 308.10±7.11 37.21±0.71 65.19±1.05 7.65±0.22 8.28±0.03 1.70±0.01 5.84±0.06

4 讨论

通过UPLC-Q-TOF-MS/MS 技术从SHD 中共鉴定88 种成分，包括26 个黄酮类成分、15 个萜类成分、17 个生物碱类成分、6 个香豆素类成分、6 个有机酸类成分、2 个苯丙素类化合物、2 个其他类成分。柴胡配以白芍，以柴胡苦辛解表泄热、疏肝解郁、升举阳气，以白芍苦酸养血滋肝、柔肝止痛、平抑肝阳，两者相配已有千年历史，在调肝方面尤长[37-38]。枳实破气散结，除痞导滞，可以用于治疗积滞内停、痞满胀痛，现代研究发现枳实有调节胃肠运动功能和抗炎的作用[39-40]。其中枳实贡献了21种成分，包括黄酮类（17 种）、有机酸类（2 种）、生物碱类（1 种）、三萜类成分（2 种）；白芍贡献了4 种成分，包括黄酮类（3 种）、有机酸类（1 种）、单萜类（2 种）和其他类成分（1 种）。本研究从柴胡中鉴定出的化合物较少，其原因可能是由于直接采用水煎煮法制备供试品溶液，而柴胡主要化学成分是皂苷类成分，加之皂苷类成分在热水中易分解，因此造成本条件下检出的柴胡皂苷较少[41-42]。后续将结合常温提取方法和UPLC-Q-TOF-MS/MS 针对皂苷类成分进行鉴定，并利用HPLC-ELSD 方法进行皂苷类成分的指纹图谱和多成分定量研究。

通过指纹图谱相似度评价结合CA、PCA 和OPLS-DA，发现不同批次SHD 样品存在一定差异并聚为2 类，其原因是样品S2、S4、S8、S10 所用的枳实为同一批药材，其余样品为同一批药材。说明影响SHD 质量差异的主要原因可能是枳实的批次不同；影响SHD 质量的差异成分共8 个，分别为槲皮苷、柚皮素、峰6、峰11、峰10、小檗碱、峰16 和峰15。其中槲皮苷在OPLS-DA 中的VIP值最大，是影响SHD 质量最为重要的成分。该提取方法中，枳实是槲皮苷含量的重要来源，在影响SHD 质量的差异成分中，枳实所提供的黄酮类成分的权重较高。

本实验前期考察了柴胡皂苷A 和姜黄素在HPLC 图中的响应，结果发现，柴胡皂苷A 色谱峰峰面积小，强度低，且信噪比（S/N）低于10∶1，不满足定量所属的条件；加之在样品中并未检出姜黄素色谱峰，故并未选择以上2 种对照品。考虑到SHD 全方组成，并参考《中国药典》对于单味药材的含量测定方法，结合前文所提及的枳实的高权重性，最终选择以下9 种对照品。其中，芍药苷归属于白芍；甘草苷归属于甘草；小檗碱归属于黄连；白术内酯II 归属于白术；木香烃内酯归属于木香；柠檬苦素归属于吴茱萸；槲皮苷、橙皮苷和柚皮素均归属于枳实。旨在全面地反映SHD 的质量优劣，在一定程度上反映了SHD 质量的差异。

本研究使用具有高灵敏度、高分辨率的液质联用技术结合文献报道和对照品指认，基本阐明了SHD 中化合物的类型以及化合物药材来源的归属；使用控制中药复方整体质量较常用的方法HPLC 法建立了SHD 的指纹图谱，两者结合，既可以提供该方所含化合物信息及其归属，又可对该方进行质量控制，为后续新药研发以及质量标准提供参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突