在线固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法快速测定水中10种抗生素

＊蒋昕庆

（湖南水科检验检测有限公司 湖南 410000）

抗生素是生物（包括动物、植物、微生物）自身产生的或者人工合成的，能在低微浓度下有选择地抑制或影响其他生物功能的有机物质[1]。按照抗生素的化学结构，可以分为6大类：林可霉素类、诺酮类、氨基糖苷类、β-内酰胺类、喹大环内酯类、四环素类[2]。随着科技发展，近年来常常有滥用抗生素的现象，使大量细菌产生耐药性，污染水体环境，在水生生物体内富集，通过食物链和环境危害人体健康。四环素、土霉素、金霉素、磺胺甲恶唑等抗生素在地表水、地下水、自来水中均有检出[3-7]。目前，用来检测残留抗生素的主要技术有免疫学分析法、微生物法和仪器分析法等，水体中多采用高效液相色谱与串联质谱联用（HPLC-MS/MS）技术、高效液相色谱仪与紫外检测仪/荧光检测仪联用技术（HPLC-UV/HPLC-FD）。本文采用在线固相萃取-超高效液相色谱串联质谱联用仪（HPLC-MS/MS）测定水中已发现对水体有污染的10种抗生素[8]，操作简单，测定结果准确，有良好的应用效果。

1.实验

（1）仪器与试剂。在线固相萃取-超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用系统（美国Thermo公司），包括二元高压泵、四元低压泵、在线脱气机、柱温箱、自动进样器；一体式氮气发生器；超声波清洗器。

喹诺酮类、磺胺类、大环内酯类、四环素类4大类10种抗生素标准物质（德国Dr.Ehrenstorfer公司）；乙腈、甲酸均为HPLC级；流动相超纯水为屈臣氏蒸馏水。

（2）标准溶液的配制。标准储备液（100mg/L）：分别称取10种抗生素标准品1mg，用乙腈分别溶解并定容至10mL，-18℃储存。

混合标准储备液（1mg/L）：分别移取0.1mL标准储备液于10mL容量瓶中，用乙腈定容。

（3）在线固相萃取条件。萃取柱为Hypersil GOLD aQ 20mm×2.1mm，粒径12μm；流动相：A超纯水，B含0.1%甲酸的乙腈，洗脱速率为1.0mL/min，梯度洗脱程序：0～5.5min为0%B，5.51～8.5min为100%B，10.7min为0%B。

表1 在线固相萃取条件

（4）色谱条件。色谱分析柱为Hypersil GOLD 50mm×2.1mm，粒径3μm；柱温：30℃；进样量：1mL；流动相：A超纯水，B含0.1%甲酸的乙腈，洗脱速率为0.3mL/min，梯度洗脱程序：0～0.5min为95%A、5%B，2～3.5min为90%A、10%B，4.5～7min为5%A、95%B， 7.01～10.5min为95%A、5%B。

表2 色谱条件

（5）质谱条件。鞘气压力：37MPa；辅助气压力：12MPa；离子传输毛细管温度：300℃；雾化温度：350℃；喷雾电压：（+）3500V；碰撞气压力：1.5MPa。采用选择反应监测模式（SRM）检测。其他参数见表3。

表3 定量离子选择

2.结果及讨论

(1)样品前处理条件优化

喹诺酮类、磺胺类、大环内酯类、四环素类4个类别的抗生素分子结构各不相同，同时保证提取效果，难度较大。本实验比较了超纯水提取、纯乙腈提取、乙腈-超纯水提取的提取效果，结果发现相较于另外两种提取方式，超纯水的提取效果较好，回收率也更高。用纯乙腈或者乙腈-超纯水提取，磺胺类物质的回收率较低，响应差，很难在液质联用仪上检测出来。

(2)质谱参数优化

通过手动进样针采用连续注射的方式，分别将质量浓度为10mg/L的10种抗生素标准溶液通过管路直接注入电喷雾离子源，在正离子模式（HESI+）下优化鞘气压力、离子传输毛细管温度、雾化温度、喷雾电压等参数，得到10种抗生素最大响应值以后，通过MRM（多反应监测）系统优化碰撞能，得到相应的母离子、定量子离子和定性子离子。

(3)标准曲线及检出限

用超纯水稀释混合标准储备液（1mg/L）制成浓度范围为1.0～10.0ng/mL的系列标准使用溶液，根据MDL=t(n-1,0.9)×SD计算本方法的检出限，根据RQL=4×MDL计算测定下限。结果表明10种抗生素在1.0～10.0ng/mL浓度范围内线性良好，相关系数大于0.99，检出限范围0.126～0.227ng/mL，且10种抗生素均能完全分离，分离度高。详见表4。

表4 标准曲线线性及检出限

表5 方法精密度（n=7）

几种典型抗生素质谱图：

图1 4ng/mL磺胺嘧啶质谱图

图2 4ng/mL头孢氨苄质谱图

图3 4ng/mL氧氟沙星质谱图

图4 4ng/mL四环素质谱图

图5 4ng/mL罗红霉素质谱图

(4)方法的回收率和精密度

①方法空白试验。采用本文所述方法进行空白试验，10种抗生素均未检出。

②方法精密度。分别配制1.00ng/mL、2.00ng/mL和8.00ng/mL的标准使用液，上机测定7次，RSD范围为0.5%～6.7%。

③方法回收率。加标回收样品采用从南方某城市采集的无抗生素检出的出厂水、管网水和原水，分别加入标准混合液，使最终浓度为2ng/mL和8ng/mL，上机测定，结果见表6。两种浓度的回收率范围为71.4%～104.8%。

表6 方法回收率

3.结论

本文采用在线固相萃取-超高效液相色谱串联质谱联用技术，建立了一种快速检测水体中多种类抗生素的检测方法，检出限低、回收率高、重复性好，可应对不同分子结构的抗生素，为进一步研究水体中抗生素的残留及去除提供参考依据。