基于Au-g-C3N4 NS纳米复合材料的分子印迹电化学发光传感器检测

叶酸 向莉 刘意明 杨敏丽

DOI： 10.3969/J.ISSN.1000-5137.2024.01.003

收稿日期： 2023-11-01

基金項目： 上海师范大学“仪器分析”课程教学团队建设项目（304-AC9103-21-368011523）

作者简介： 向 莉（1998—）， 女， 硕士研究生， 主要从事电化学发光传感器等方面的研究. E-mail： xl120421@163.com

* 通信作者： 杨敏丽（1965—）， 女， 教授， 主要从事生物传感器及电化学发光分析等方面的研究. E-mail：yml_nx@shnu.edu.cn

引用格式： 向莉， 刘意明， 杨敏丽. 基于Au-g-C3N4 NS纳米复合材料的分子印迹电化学发光传感器检测叶酸 ［J］. 上海师范大学学报 （自然科学版中英文）， 2024，53（1）：17?27.

Citation format： XIANG L， LIU Y M， YANG M L. A molecule-imprinted electrochemiluminescence sensor based on Au-g-C3N4 NS nanocomposite for detection of folic acid ［J］. Journal of Shanghai Normal University （Natural Sciences）， 2024，53（1）：17?27.

摘  要： 近年来，作为一种新型的二维半导体纳米材料，石墨相氮化碳纳米薄片（g-C3N4 NS）因其优异的电化学发光（ECL）性能和良好的成膜特性在ECL传感领域备受关注。然而，g-C3N4 NS在较高的工作电压下产生的ECL信号不稳定，而金纳米粒子（Au NPs）的引入可明显改善其发光稳定性. 基于这个特点，采用原位生长法将Au NPs引入g-C3N4 NS中，制备了一种金-石墨相氮化碳纳米复合材料（Au-g-C3N4 NS），以其作为ECL物质固定在电极上. 同时，引入具有专一识别能力的分子印迹聚合物（MIP），构建了一种检测叶酸（FA）的分子印迹-电化学发光（MIP-ECL）传感器. 该传感器对FA表现出良好的选择性和灵敏响应，在优化的条件下，信号变化与FA物质的量浓度在1.0×10-10～1.0×10-3 mol·L-1的范围内呈良好的线性关系，检出限（LOD）达到0.07 nmol·L-1. 并且探讨了检测机理，考察了传感器的稳定性和重现性，将传感器用于实际样品中FA的检测，获得满意结果.

关键词： 电化学发光（ECL）； 金-石墨相氮化碳纳米复合材料（Au-g-C3N4 NS）； 分子印迹聚合物（MIP）； 叶酸（FA）

中图分类号： O 657.1    文献标志码： A    文章编号： 1000-5137（2024）01-0017-11

Abstract： As a new type of two-dimensional semiconductor nanomaterials， graphite-phase carbon nitride nanosheets（g-C3N4 NS） have attracted much attention in the field of electrochemiluminescence（ECL） sensing due to their excellent ECL performance and excellent film forming properties. However， the ECL signal generated by g-C3N4 NS is unstable at higher operating voltages. The introduction of gold nanoparticles（Au NPs） can significantly improve the luminescence stability. Accordingly， Au NPs were introduced into g-C3N4 NS through in situ growth to obtain Au-g-C3N4 NS which was fixed on the electrode as the ECL substance. Meanwhile， a molecularly imprinted polymer（MIP） with specific recognition ability was introduced to construct a MIP-ECL sensor for detecting folic acid （FA）. The sensor showed a high selectivity and sensitivity to FA. The ECL signal showed a good linear relationship with FA concentration in the range of 1.0×10-10-1.0×10-3 mol·L-1， and the limit of detection（LOD） was 0.07 nmol·L-1. The sensor was used to detect folic acid in the samples， and satisfactory results were obtained.

Key words： electrochemiluminescence（ECL）； Au-g-C3N4 NS nanocomposite（Au-g-C3N4 NS）； molecularly imprinted polymer（MIP）； folic acid（FA）

0  引 言

叶酸（FA），又称维生素B9，是一种水溶性维生素，对细胞的生长和分化至关重要［1-2］. 人体内缺乏FA会引发一系列慢性疾病，包括精神病、癌症、中风、巨红细胞性贫血、白细胞减少和智力退化等. 过量的FA会干扰维生素B12和锌的吸收，导致其他健康问题［3-5］. 因此，為了规避这些风险，对临床人体生物样品中FA的定量检测非常必要.

目前，检测FA的方法主要有高效液相色谱法［6-7］、荧光法［8-9］、化学发光法［10-11］、电化学法［12］等. 这些方法都有各自的优点，但是也存在各自的问题，例如高效液相色谱法的样品预处理复杂、分析成本高；荧光法易受到背景和猝灭效应的影响；化学发光法可用体系有限；电化学方法的重复性较差. 电化学发光（ECL）是利用电化学反应诱导产生化学发光的一种检测方法，具有简单、灵敏、快速、高效的优点，受到众多分析工作者的青睐. 但ECL检测存在的一个最大问题是共存物质的干扰. 排除干扰最有效的办法是利用生物亲和反应，通过相应适体［13］或抗原与抗体［14］的特异性反应来提高选择性. 但昂贵的生物试剂使检测成本大大提高，而且操作变得复杂，条件苛刻. 近几年，人们更倾向于分子印迹技术. 分子印迹聚合物（MIP）是一种由功能单体和模板分子聚合产生的人工受体，它对目标分析物具有特异性识别作用，而且MIP 稳定性好、制备简单、成本低，被广泛应用于化学传感领域［15-16］.

石墨相氮化碳纳米薄片（g-C3N4 NS）是一种新型的ECL纳米材料，具有制备简单、成本低廉、生物相容性好、性能稳定等优点. 在g-C3N4 NS中引入金纳米粒子（Au NPs），可进一步改善其导电性和发光稳定性. 本文制备了一种Au-g-C3N4 NS纳米复合材料，结合MIP技术，构建了一种测定FA的分子印迹-电化学发光（MIP-ECL）传感器. 传感器对FA的线性响应范围在1.0×10-10～1.0×10-3 mol·L-1，检出限（LOD）为0.07 nmol·L-1.

1  实验部分

1.1 实验试剂

三聚氰胺（C3H6N6）、过硫酸钾（K2S2O8）、FA均购于上海Aladdin工业公司；无水乙醇、四水合氯金酸（HAuCl4·4H2O）购于Sigma-Aladdin；丙烯酰胺（AAM）、硼氢化钠（NaBH4）、柠檬酸钠、磷酸二氢钾（KH2PO4）、磷酸氢二钾（K2HPO4）、氯化钾（KCl）、盐酸（HCl）、氢氧化钠（NaOH）、多巴胺（DA）、酪氨酸（Tyr）、尿酸（UA）、抗坏血酸（AA）、葡萄糖（Glu）均购于上海Adamas试剂公司. 所有药品均为分析纯，溶液用超纯水配制.

1.2 实验仪器

透射电子显微镜（TEM），日本电子公司，JEM-2010；紫外分光光度仪，日本岛津公司，UV-1800；荧光分光光度仪，日本岛津公司，RF-5301PC；恒温干燥箱，上海跃进医疗器械厂，GZX-DH-X；离心机，上海安亭科学仪器厂，TGL-16C；数控超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司，KQ-100DE；恒温磁力搅拌器，上海梅颖浦仪器制造有限公司，95-I；pH计，上海洛奇特电子设备有限公司，PHS-25；马弗炉，上海慧泰仪器制造有限公司，PRD-C3000；电化学工作站，上海辰华仪器有限公司，CHI 660E；ECL分析系统，西安瑞迈分子仪器责任有限公司，MPI-A/B三电极系统，工作电极为玻碳电极（GCE），铂（Pt）丝为对电极，银/氯化银（Ag/AgCl）电极（饱和KCl溶液）为参比电极.

1.3 g-C3N4 NS的合成

按照前期报道的方法合成g-C3N4 NS，具体方法见文献［17］.

1.4 Au-g-C3N4 NS纳米复合材料的制备

Au-g-C3N4 NS的合成采用原位生长法［18］：（1） 将10 μL 0.01 mol·L-1的HAuCl4·4H2O溶液倒入不断搅拌的2 mL 1 mg·L-1的g-C3N4 NS分散液中，超声10 min后继续室温搅拌2 h；（2） 向溶液中快速加入25 μL新制的0.01 mol·L-1 NaBH4溶液，持续搅拌20 min，使四氯合金离子（AuCl4-）还原为Au；（3） 向上述溶液中添加10 μL 0.01 mol·L-1柠檬酸钠溶液，搅拌30 min，柠檬酸钠作为稳定剂保护金属的成核位点；（4） 将溶液离心，除去多余的NaBH4、柠檬酸钠和未结合的Au NPs，用去离子水彻底清洗沉淀. 最后，将其分散于1 mL水中待用. 此材料标记为Au-g-C3N4 NS.

1.5 MIP-ECL传感器的构建

传感器的构建过程如图1所示. 先用0.5 μm 氧化铝（Al2O3）反复抛光GCE至光滑，用无水乙醇和去离子水超声冲洗. 取6.0 μL Au-g-C3N4 NS悬浮液滴涂在处理好的GCE上，室温晾干. 将此电极插入含有3 mmol·L-1 FA与9 mmol·L-1 AAM的0.1 mol·L-1磷酸缓冲溶液（PBS）（pH=7.5）溶液中，在0～1.4 V电压范围内扫描10圈，在电极表面引入MIP膜，记为MIP/Au-g-C3N4 NS/GCE修饰电极. 将该修饰电极浸入无水乙醇和2 mol·L-1 NaOH的混合溶液（体积比为7∶3），浸洗20 min，除去FA模板分子，得到能特异性结合FA的分子印迹传感器，记为MIP-ECL传感器. 作为比较，用同样方法（聚合液中不含FA）制备了非分子印迹传感器（NIP-ECL）.

图1 MIP-ECL传感器构建及其对FA的响应

1.6 ECL检测

采用三电极系统，以修饰电极为工作电极，Pt丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，插入到pH=7.5的0.1 mol·L-1 PBS溶液（含0.1 mol·L-1 K2S2O8）中，在0～-1.5 V的范围内以100 mV·s-1的扫速扫描，记录ECL信号（光电倍增管电压为-600 V）. 检测FA时，将制备好的MIP-ECL传感器浸入含不同物质的量浓度FA的PBS（0.1 mol·L-1，pH=7.5）中，孵育15 min，取出后用蒸馏水冲洗干净，除去非特异性吸附的FA，再转入ECL检测底液中，按照上述方法测试ECL信号.

2  结果与讨论

2.1 Au-g-C3N4 NS的表征

图2是g-C3N4 NS和Au-g-C3N4 NS的TEM图. 可以看出，g-C3N4 NS呈现均匀的二维片状结构，加入Au NPs后，其表面分布了大量黑色圆点，证明Au NPs被成功掺入到g-C3N4 NS中.

图2 （a） g-C3N4 NS和（b） Au-g-C3N4 NS的TEM图

为了进一步证明Au-g-C3N4 NS的成功合成，分别测试了g-C3N4 NS和Au-g-C3N4 NS的紫外-可见吸收（UV-vis）谱图，如图3所示. 与g-C3N4 NS（黑线）比较，Au-g-C3N4 NS（红线）在520 nm出现了新的吸收峰，这恰好对应着Au NPs特征吸收峰［18］，进一步证明Au-g-C3N4 NS的成功合成.

图3 g-C3N4 NS（黑线）和Au-g-C3N4 NS（红线）的UV-vis谱图

2.2 Au NPs的作用

Au NPs具有比表面积大、导电性良好的特点，常被用来修饰电极以提高检测的灵敏度［19］. 本研究将Au NPs掺入到g-C3N4 NS中，比较了掺入前后的ECL信号. 发现在0～-1.0 V电位窗口下，g-C3N4 NS能发射稳定的ECL信号，当电位窗口扩大到0～-1.5 V时，其ECL信号变得不够稳定，呈现出逐步下降的趋势；而掺入Au NPs后，在0～-1.5 V窗口下的信号保持稳定，而且信号强度有所增加. 说明Au NPs的掺入能够稳定g-C3N4 NS，同时还可以提高信号强度. 分析原因为在较高的负电位下，高能量电子大量注入到g-C3N4 NS导带中，使电极表面发生钝化，阻碍了g-C3N4 NS与溶液中共反应剂过硫酸根离子（S2O82-）的反应，从而使ECL信号下降. 当Au NPs掺入到g-C3N4 NS中后，它能够接收更多过量的电子，避免了过量电子注入g-C3N4 NS导带而导致电极表面钝化的现象，从而使ECL信号保持稳定［20］. 同时，其良好的导电性加快了电子转移速度，使信号进一步增强.

2.3 MIP-ECL传感器的表征

为了验证传感器制备成功，分别记录了电极修饰过程中的电化学阻抗谱（EIS）、循环伏安（CV）和ECL信号，如图4所示.

图4 不同修饰电极的（a） EIS响应曲线、（b） CV响应曲线及（c） ECL响应曲线

图4（a）是不同修饰电极在5 mmol·L-1 ［Fe（CN）6］3-/4-（含0.1 mol·L-1 KCl）溶液中的EIS谱图. 与裸电极（黑线）相比，修饰g-C3N4 NS后电极的电荷转移电阻（Rct）有所增大（红线），这是因为g-C3N4 NS的半导体性质导致电子传递速率降低. 引入Au NPs后，Au-g-C3N4 NS/GCE的Rct明显降低（蓝线），这是因为Au NPs良好的导电性能，提高了电子迁移速率. 当MIP膜引入后，Rct明显增大（橙线），因为非导电性的MIP膜阻碍了电极表面的电子传导，这一结果表明：MIP膜成功修饰到了电极表面. 当FA被洗掉后，MIP膜出现了许多与FA互补的空腔，所以电子传递速率加快，Rct降低（粉线）. 再次吸附FA后，空腔又被阻塞，影响了电子传递速率，Rct变大（绿线）.

同样，在5 mmol·L-1 ［Fe（CN）6］3-/4-（含0.1 mol·L-1 KCl）溶液中，研究了不同修饰电极的CV行为，如图4（b），其信号变化与EIS变化趋势吻合.

图4（c）是不同修饰电极在0.1 mol·L-1的PBS（pH=7.5，含0.1 mol·L-1 K2S2O8）溶液中的ECL信号. 与裸GCE相比，g-C3N4 NS/GCE具有较强的ECL信号，说明g-C3N4 NS是一种优异的ECL材料. 当在电极上引入Au-g-C3N4 NS后，ECL信号进一步增强，说明掺杂Au NPs会提高g-C3N4 NS ECL的发光强度. 然而，在Au-g-C3N4 NS/GCE上引入MIP膜后，ECL強度显著降低，这是由两个原因引起的：一是FA自身可淬灭Au-g-C3N4 NS的ECL信号；二是由于MIP膜的物理阻碍效应. 当模板分子被洗脱后，ECL强度再次增加. 同样，吸附FA后的ECL值会减小.

2.4 实验条件的优化

为获得最佳的实验结果，对检测底液的pH值、模板分子与功能单体比例、FA的洗脱和孵育时间进行了优化，如图5所示.

图5 不同检测条件对MIP-ECL传感器的影响. （a） 检测底液的pH值； （b） 模板分子FA与功能单体AAM的物质的量之比；

（c） FA的洗脱时间；（d）FA的孵育时间

图5（a）为检测底液的pH值对传感器ECL信号的影响. 当pH值从6.5增加到7.5时，ECL信号逐渐增大；pH=7.5时，ECL信号达到最大；继续增加pH值，ECL信号又减小. 因此，选择检测底液的pH值为7.5.

图5（b）为目标分子FA与功能单体AAM的比例对ΔECL信号（ΔECL为模板分子洗脱后的ECL信号与洗脱前的ECL信号的差值）的影响. 固定FA的量为0.3 mmol，改变AAM的量，可以看出FA与AAM的物质的量之比为1∶3时，洗脱前后ECL信号变化最大. 这是因为，AAM过少会导致聚合物膜的不均匀、不稳定，形成信号的特异性识别位点较少；相反，AAM的量过多则会导致聚合物膜太厚，影响电子传递. 所以选择FA与AAM的物质的量之比为1∶3.

图5（c）为不同洗脱时间下的ECL信号. 将含有模板分子的MIP/Au-g-C3N4 NS/GCE电极插入乙醇和NaOH（2.0 mol·L-1）的混合溶液中（体积比为7∶3），测量不同洗脱时间对应的ECL信号. 可以看出，随着洗脱时间延长，ECL信号逐渐增大，当洗脱时间达到20 min后，ECL信号达到最大，继续延长洗脱时间，信号基本保持不变，表明膜内的FA分子被洗脱完全，因此选择洗脱时间为20 min.

图5（d）为FA孵育时间的优化. 将去除模板分子FA的电极重新插入1.0×10-5 mol·L-1的FA溶液中孵育，记录不同孵育时间下的ECL信号. 孵育时间从5～15 min，ECL信号一直降低，15 min后ECL信号基本保持不变. 故选择孵育时间为15 min.

2.5 传感器对FA的ECL响应

将MIP-ECL传感器插入不同浓度的FA溶液中，孵育15 min后取出，用蒸馏水冲洗干净，再转入含0.1 mol·L-1 K2S2O8的PBS溶液（0.1 mol·L-1，pH=7.5）中，测试ECL信号. 如图6所示，随FA浓度增加，ECL信号不断降低. ECL信号的降低值与FA浓度对数在1.0×10-10～1.0×10-3 mol·L-1范围内呈良好线性关系. 线性回归方程为I0-I=1 567.8 lg C–1 616.5（相关系数为0.993 9），其中I0是空白溶液（不含FA）的ECL强度，I是物质的量浓度为C（mol·L-1）的FA对应的ECL强度. LOD为0.07 nmol·L-1（信噪比S/N=3）. 表1是本方法与其他方法检测FA的比较，本方法具有较低的LOD和较宽的线性范围.

图6 （a） 不同物质的量浓度FA的ECL信号和（b） FA物质的量浓度的对数值与ECL信号变化值之间的线性关系

2.6 ECL机理探究

为了探究FA对Au-g-C3N4 NS/K2S2O8体系的ECL抑制机制，从两方面考虑：一是化学反应导致的信号猝灭；二是光学作用引起的猝灭［26-27］. 如果体系中发生化学反应导致信号猝灭，有两种途径：（1） FA消耗共反应剂K2S2O8引起ECL降低；（2） FA与发光物质Au-g-C3N4 NS反应，引起信号降低. 分别测试了FA，K2S2O8及两者混合后的UV-vis谱图，如图7（a）所示，FA在240 nm和360 nm处有2个吸收峰，K2S2O8在250 nm后无吸收，两者混合后没有产生新的吸收峰，FA吸收光谱也没有改变，说明两者没有发生化学反应. 同样，分析了FA，Au-g-C3N4 NS及两者混合后的UV-vis光谱，如图7（b）所示，可以看出两者的混合物保留了原来FA和Au-g-C3N4 NS各自的特征吸收峰，没有新的吸收峰出现，说明FA与Au-g-C3N4 NS之间也没有发生化学反应. 所以可以排除 FA与共反应剂或发光物质发生反应导致ECL信号猝灭的可能.

图7 FA对体系ECL抑制机理探究. （a） FA，K2S2O8及它们混合溶液， （b） FA，Au-g-C3N4 NS及它们混合溶液的UV-vis光谱图； （c） FA加入前后Au-g-C3N4 NS的荧光光谱； （d） FA的UV-vis光谱与Au-g-C3N4 NS的ECL光谱

为了进一步探究抑制机理，测试了FA对Au-g-C3N4 NS荧光信号影响，如图7（c）所示，FA对Au-g-C3N4 NS荧光信号有淬灭作用，由此推测FA对Au-g-C3N4 NS的ECL的猝灭可能是由于光学作用引起的. 图7（d）是FA的UV-vis光谱与Au-g-C3N4 NS的ECL光谱，两者几乎没有重叠，因此排除了能量转移的可能性. 比较图7（b）中FA与Au-g-C3N4 NS的UV-vis光谱，发现两者在200～400 nm范围内有较大重叠. 根据文献［28］，当两种物质的吸收峰有重叠时，两者之间会发生电子转移. 因此，推测FA对Au-g-C3N4 NS猝灭很可能是由于兩者之间的电子转移效应引起的. 当FA存在时，激发态的Au-g-C3N4 NS*将导带电子转移到FA的π*轨道上，导致Au-g-C3N4 NS*数量减少，所以ECL信号降低，抑制机理如图8所示.

图8 FA对Au-g-C3N4 NS/K2S2O8体系的抑制机理

2.7 传感器的选择性、稳定性、重现性

选择性测试：选择几种常见的与FA共存的生物物质，包括Glu，Tyr，UA，AA和DA进行选择性测试. 先测试传感器对这几种物质各自的响应，再将100倍浓度的这些物质分别加入到1.0×10-5 mol·L-1的FA溶液中，测试传感器对混合液的响应. 如图9（a）所示，可以看出，传感器只对FA产生响应，而对其他几种物质几乎没有响应. 当它们与FA共存时，也不会影响FA的信号，说明它们的存在不会干扰FA的测定，证明传感器对FA有很好的选择性. 这主要是因为该传感器引入了对FA具有特异性识别的MIP膜，该膜可选择性吸附FA，而排除其他物质的干扰.

图9 传感器的性能测试. （a） MIP-ECL传感器对FA的选择性（空白，FA，Glu，Tyr，UA，AA和DA）； （b） 连续扫描10圈的稳定性； （c） 传感器储存5周的稳定性； （d） 6根不同电极的重现性（扫描电位从0～1.5 V，扫速为100 mV·s-1）

稳定性测试：采用连续扫描的方法测试了传感器的稳定性，如图9（b）所示. 在0～1.5 V的范圍内连续扫描10圈，ECL信号无明显改变，相对标准偏差（RSD）为2.1 %. 把制备好的传感器置于4 ℃环境中，每隔1周测试ECL信号，如图9（c）所示，5周内ECL信号基本保持稳定.

重现性测试：取6个不同的电极，按照相同的方法制备传感器，测试其ECL信号，如图9（d）所示，6个传感器的RSD为2.3 %. 证明本方法制备的传感器具有良好的重现性.

2.8 实际样品的分析

为了验证MIP-ECL传感器的可靠性和实用性，对正常人血清样本（来自上海师范大学校医院）中的FA进行了测定. 先将样品用0.45 μm滤膜过滤，并以10 000 r·mins-1离心10 min去除沉淀物，得到的上清液用0.1 mol·L-1的PBS（pH=7.5）稀释5倍，采用标准加入法进行分析，结果如表2所示，方法的回收率为96.0%～101.0%，RSD为2.4%～3.1%. 结果表明：所构建的MIP-ECL传感器可应用于实际样品中FA的检测.

3  结 论

本工作采用原位生长法在发光物质g-C3N4 NS的表面引入Au NPs，改善了g-C3N4 NS在高电位下发光信号不稳定的问题. 然后，以其为ECL物质，结合MIP技术，构建了一种对FA具有特异性响应的MIP-ECL传感器，将该传感器应用于实际样品人血清中FA的检测，获得满意结果. 同时，传感器表现出良好的稳定性和重现性. 与其他检测FA的方法相比较，本文所提出的方法简单、使用方便、成本低.

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（責任编辑：郁慧，顾浩然）