复合酸化剂对大肠杆菌和沙门菌的体外抑菌效果探讨

李明举 杨小台 赵玮 戚卿业 由佳

摘  要：随着饲料中禁止添加除中草药外的药物饲料添加剂，畜禽生产中消化道和呼吸道疾病的发病率普遍升高。药物投入增加和抗生素替代产品价格较高，导致饲养成本增加的问题凸显，高效绿色抗生素替代产品的寻找已成为畜禽业关注的重点。本文通过对鸡场中分离到的大肠杆菌和沙门菌进行复合酸化剂体外抑菌试验，研究复合酸化剂对常见细菌的杀灭和抑制效果，为在养殖业中的合理使用提供参考。

关键词：复合酸化剂；大肠杆菌；沙门菌；最小抑菌浓度；抑菌效果

中图分类号：S854.4+3 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2024）01-0080-04

酸化剂可作为添加剂用于饲料中，养殖场常用的酸化剂主要有柠檬酸、延胡索酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、苯甲酸及其盐类，有的还混有适量的苹果酸、琥珀酸、山梨酸和磷酸。由一种有机酸组成的酸化剂（简称“单一酸化剂”）存在功能简单、添加量大、腐蚀性强、适口性差等缺点；由多种有机酸组成的复合酸化剂，能够降低畜禽胃肠道内腔的pH，对大肠杆菌、沙门菌、葡萄球菌和梭菌等细菌具有杀灭和抑制作用，同时，还能够调节肠道菌群结构和平衡，促进畜禽的生长和消化吸收，提高生产性能。因此，与单一酸化剂相比，复合酸化剂具有更多的优点。本研究将从病死鸡上分离到的大肠杆菌和沙门菌菌株复苏，通过测定两种复合酸化剂的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC），比较两种复合酸化剂对大肠杆菌和沙门菌的体外抑菌效果。

1  材料

1.1 试验菌株和复合酸化剂

试验菌株为从鸡场病死鸡上分离的大肠杆菌和沙门菌。复合酸化剂有A、B两种。

1.2 试验材料

无菌试管和三角烧瓶，营养琼脂平板，营养肉汤，2倍浓缩营养肉汤，8×100 ?L排枪，200 ?L移液器，1 mL移液器，96孔细胞培养板，灭菌水，无菌的0.22 ?m过滤器，分光光度计，酶标仪。

2  方法

2.1 菌株复苏

取大肠杆菌、沙门菌冻存液各0.1 mL，分别接种到含有5 mL营养肉汤的试管中，37 ℃摇床振荡培养6 h。

2.2 菌液稀释

用分光光度计将菌液中的细菌数调整至1.5×10⁸CFU/mL。用营养肉汤将调整好的菌液稀释1 000倍，用于测定MIC。

2.3 酸化剂预处理

取10 mL的复合酸化剂A和复合酸化剂B，分别加入10 mL的2倍浓缩营养肉汤，混匀，备用。

2.4 最小抑菌浓度（MIC）测定^[1]

2.4.1 加入营养肉汤

在96孔细胞培养板上每孔加入100 ?L的营养肉汤。

2.4.2 加受试溶液并梯度稀释

在96孔细胞培养板前4行的第2列（A2，B2，C2，D2）加入100 ?L预处理的复合酸化剂A，向该培养板后4行的第2列（E2，F2，G2，H2）加入100 ?L预处理的复合酸化剂B，用排枪混匀后吸取100 ?L到第3列中，混匀，再从第  3列中吸取100 ?L到第4列中，如此依次稀释第11列，从第11列吸取100 ?L溶液弃掉。

2.4.3 加稀释好的菌液

在96孔细胞培养板第1、2、5和6行，自第12孔向第2孔加入100 ?L大肠杆菌液（细菌数为1.5×10⁵CFU/mL），向该培养板第3、4、7和8行，自第12孔向第2孔加入100 ?L沙门菌液（细菌数为1.5×10⁵CFU/mL）。96孔细胞培养板第1列再加入100 ?L的营养肉汤，即第1列只有200 ?L的营养肉汤，不加酸化剂和菌液，作为阴性对照；细胞培养板第12列只有营养肉汤和菌液，不加酸化剂，作为阳性对照。

2.4.4 细菌培养

将96孔细胞培养板放置振荡器上轻轻振荡混匀，注意不要把孔内液体振出，然后放入   37 ℃恒温培养箱中培养。

2.4.5 读取结果

分别在培养18 h和30 h读取MIC结果，自右向左完全不长菌的第1孔为受试溶液的MIC。可将96孔细胞培养板放入酶标仪中，测定    630 nm时的吸光度（optical density，OD），以OD630 nm值与200 ?L营养肉汤（阴性对照）一致的孔作为完全不长菌的阴性孔（图1、图2）。

3  結果及分析

由表1得知，复合酸化剂A和B对大肠杆菌和沙门菌均具有抑制细菌生长的作用，培养18 h 后MIC结果显示，试验中选用的两种复合酸化剂的最低抑菌浓度相同，均为0.2％（体积分数）。由表2得知，随着时间的增加，复合酸化剂A和B对两种细菌的抑菌作用逐渐减弱，细菌开始繁殖；从浑浊度来看，复合酸化剂A和B对大肠杆菌的抑菌作用稍好于对沙门菌的，但相互间差异不大；复合酸化剂A的抑菌效果稍好于复合酸化剂B的，但差异不大。

4  讨论

4.1 酸化剂在抑制细菌方面的研究

叶帮同等^[2]指出，酸化剂的作用机理主要是破坏细菌细胞壁，干扰细菌酶合成，抑制细菌内酶的活性，影响致病菌DNA的复制，大肠杆菌、沙门菌和梭状芽孢杆菌在肠道内生长的最适pH分别为6.0～8.0、6.8～7.2和6.0～7.5，而乳酸杆菌生长的最适pH为5.4～6.4，酸化剂可以将肠道内腔pH降低到6.0以下，从而抑制有害微生物的繁殖，同时促进有益菌的增殖。雷燕等^[3]在同等酸度条件下比较了单一酸化剂及复合酸化剂的体外抑菌效果，结果发现复合酸化剂的抑菌效果优于单一酸化剂的。严欣茹等^[4]研究了复合酸化剂和抗生素对大肠杆菌、沙门菌等常见致病菌的体外抑菌效果，发现复合酸化剂对沙门菌和大肠杆菌的抑菌效果优于抗生素的，建议在日粮中添加适量的复合酸化剂。

4.2 酸化剂的应用前景

酸化剂作为一种无残留、无耐药性、无毒副作用的产品，具有调节动物机体肠道内腔pH、抑菌杀菌、提高酶活性、促进禽畜生长以及改善机体免疫功能等作用，在畜禽饲养中越来越受到广泛的关注。尤其是在蛋鸡生产中，酸化剂可提高日粮蛋白质的转化率，缓解应激反应导致的呼吸性碱中毒，调节因机体代谢加强而引发的钙磷比例失调以及产蛋率和蛋品质的下降，因而在提高蛋鸡生产性能和蛋品质方面具有重要作用。

参考文献

[1] 关飞，尤永君，安俊峰．三种酸化剂最小杀菌浓度（MBC）的测定[J]．中国动物保健，2015，17（4）：71-73.

[2] 叶帮同，李孟伟，陈清华．酸化剂的作用机理及应用[J]．湖南饲料，2015（3）：38-40.

[3] 雷燕，李瀚林，曾凡坤，等．不同单一酸化剂及复合酸化剂体外抑菌能力比较研究[J]．现代畜牧兽医，2021（7）：28-31.

[4] 严欣茹，董瑷榕，罗璋，等．磷酸复合型酸化剂及抗生素添加剂体外抑菌效果研究[J]．畜牧产业，2020（9）：65-70.

*通信作者：由佳（1982－ ），女，高级兽医师，主要从事畜牧兽医技术推广工作