开心散联合氟西汀改善慢性压力应激小鼠抑郁样行为的效应评价研究＊

李 璇，李 鑫，陈 杨，仝佳祥，黄灵欣，伍嘉慧，董婷霞，詹华强，段金廒，朱 悦＊＊

（1.南京中医药大学药学院，江苏省方剂研究重点实验室/江苏省方剂高技术研究重点实验室/中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心/江苏省中药资源产业化过程协同创新中心 南京 210023；2.香港科技大学生命科学部中药研发中心 香港 999077）

抑郁症是一种以情绪低落、兴趣减低、思维迟缓为主要症状的情志疾病[1-2]。据WHO 统计，全世界有超过3.5 亿人受抑郁症困扰，已成为世界第四大疾病。受COVID-19 影响，2020 年全球范围内重度抑郁症增加了28%[3]。抑郁症患者持久心境低落，生活质量严重降低，同时也是自杀的高危人群。即使在非自然死亡人群中，抑郁症患者高达30%的比例也远远高于其他精神疾病患者。因此抑郁症已成为危害公众身心健康的重大疾病[4-5]。

长期以来，5-羟色胺与多巴胺等单胺类神经递质在突触间隙的重摄取障碍与表达下降，被认为是抑郁症的主要病理机制[6-7]。现有抗抑郁药物如氟西汀、帕罗西汀与文拉法辛等，均以抑制5-羟色胺在突触间隙的重新摄取来提高其突触间隙浓度为作用靶点。但这些药物除了具有胃肠不适、睡眠障碍、性功能障碍等副作用之外，且对30%-50%患者无效。而对这些药物有反应的患者，又普遍存在起效时间延迟（2-6 周）、缺乏认知改善甚至损害认知、甚至加剧部分患者自杀倾向等严重问题[8-9]。现代研究发现，抑郁症的发病机制尚涉及神经生长与可塑性障碍、中枢神经炎症、“下丘脑-垂体-肾上腺”压力应激系统亢进等多种环节，靶点单一的神经递质再摄取抑制剂无法有效满足抑郁症的治疗需要[10-11]。因此中药复方多成分、多靶点、多途径的作用特点使其在抗抑郁临床应用备受关注，并有将甘麦大枣汤、逍遥散、越鞠丸等与氟西汀联用进行抗抑郁的诸多报道，发现联合用药可以提升抗抑郁起效时间，减少不良反应，提升患者治疗依从性，但是这些报道多为临床观察，对其联合用药的作用环节与机制缺乏深入研究[12-15]。

开心散始载于唐代“药王”孙思邈《备急千金要方》。由人参、远志、石菖蒲、茯苓组成，治疗“心气不足，五脏不足，甚者忧愁悲伤不乐，忽忽喜忘，朝差暮剧，暮差朝发狂眩”与“好忘”，非常类似于今天的抑郁症与老年痴呆症。该方是经中医临床验证有效的轻、中度抑郁症治疗方剂，并被纳入2018年国家中医药管理局公布的首批古代经典名方目录[13]。临床也发现，以开心散为组方基础的安神定志方与抗抑郁西药联用后起效更快，并显著缩短病程治疗，降低胃肠道不良反应[16]。因此本研究将基于慢性压力应激小鼠抑郁模型，考察开心散与氟西汀联合用药的抗抑郁效用；并在此基础上探索联合用药的作用环节与机制，以期为中西药联合治疗抑郁症提供更多的现代科学证据。

1 材料

1.1 动物

健康SPF 级ICR 小鼠，雄性，体质量20-23 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物合格证号为SCXX（沪）2022-0005。动物饲养于南京中医药大学实验动物中心SPF 环境中，常规饲养，温度22-25℃，湿度40%-70%，光照周期为12 h。本实验方案获得南京中医药大学动物实验伦理委员会的批准，伦理编号为202206A036。

1.2 药物

1.2.1 药材

人参（Panax ginsengC.A.Mey，批号：220801）、石菖蒲（Acorus tatarinowiiSchott，批号：220621）、茯苓（Poria cocos(Schw.) Wolf，批号：220701）、远志（Polygala tenuifoliaWilld，批号：210601）采购于苏州市天灵中药饮片有限公司，经南京中医药大学鉴定教研室刘圣金教授鉴定为合格药材。

1.2.2 实验试剂

氟西汀盐酸盐（≥98%）购自上海阿拉丁生化科技有限公司（F131623-25 g）；蔗糖购自上海阿拉丁生化科技有限公司（S112228-500 g）；小鼠皮质醇（Cortisol）ELISA 试剂盒（AF30178-A）、小鼠促肾上皮质激素释放因子（CRF）ELISA 试剂盒（AF2554-A）、小鼠促肾上腺皮质激素（ACTH）ELISA 试剂盒（AF2110-A）均购自湖南艾方生物科技有限公司; 实验所用抗体Caspase-3 Antibody、Caspase-9 Antibody、Anti-rabbit IgG 均购自CST 公司，β-actin Monoclonal Antibody 购自湖南艾方生物科技有限公司。

1.3 仪器

小鼠电子计重秤（YHW-L01，英衡）、精密分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）、旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）、全自动样品快速研磨仪（上海净业信发展有限公司）、AXIO Vert.A1 荧光倒置显微镜、ImageXpress Pico 自动细胞成像系统和Cell ReporterXpress 自动成像分析软件（上海美谷分子仪器公司）、凝胶成像系统（Bio-Rad）。

2 方法

2.1 开心散提取物的制备

称取人参、远志、石菖蒲、茯苓四种药材共100 g，比例为3∶2∶2∶3，加入1000 mL水，回流提取2 h，过滤。重复上述回流提取过程并合并两次回流提取液，减压浓缩至浓度为1 g·mL-1。

2.2 CUMS模型建立及分组

动物安置7 天以适应环境，进行体质量与糖水偏嗜率测试，剔除数值异常小鼠。选取测试评分正常的小鼠80 只，随机分为8 组，每组10 只。组别分别为空白组（Control）、模型组（Model）、开心散组（KXS）、氟西汀低量组（FXT-L）、开心散+氟西汀低量组（KXS+FXT-L）、氟西汀中剂量组（FXT-M）、开心散+氟西汀中剂量组（KXS+FXT-M）、氟西汀高剂量组（FXT-H）。空白组小鼠与模型小鼠分开饲养，不给予任何刺激。模型小鼠每天随机给予不同的1-2 种刺激，刺激方式包括：禁水24 h、禁食24 h、斜笼、电击、束缚4 h、湿笼、昼夜颠倒。每周进行体质量和糖水偏嗜测试，记录小鼠体质量变化与糖水偏嗜率。持续6 周，待抑郁表型出现后，对抑郁小鼠进行灌胃给药。动物的分组和给药剂量详见表1。

表1 小鼠分组和给药剂量

2.3 行为学检测

采用糖水偏嗜实验评价小鼠的抑郁样行为，具体过程参照本课题组已发表过文章[17]。

2.4 ELISA法测定压力应激因子的表达

行为学测试结束后小鼠眼眶取血，静置2 h 后离心2 次，20 min 后取上清。按照小鼠各ELISA 试剂盒所列步骤，测定小鼠血清中压力应激因子的水平。

处死小鼠快速剥取大脑海马和下丘脑，用PBS 冲洗，迅速冷冻在-80℃冰箱中。使用精密天平每组称取一定量组织，用PBS 溶液低温研磨，制成10%的匀浆液。取上清，按照小鼠ELISA 试剂盒所列步骤，测定小鼠海马和下丘脑组织中压力应激因子的水平。

2.5 脑片HE染色

小鼠行为学测试后，解剖受试动物，取出完整大脑，用冰冷的生理盐水冲洗，4%的多聚甲醛固定72 h。梯度蔗糖脱水，将固定的脑组织常规处理石蜡包埋，旋转切片机切取5 µm 切片。切片用苏木精染色10 min，蒸馏水洗2 次，于70%乙醇中分化20-30 s，伊红复染10 min，蒸馏水洗2 次，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后中性树胶封片。光学显微镜下观察小鼠海马切片的病理情况，光学显微镜下观察小鼠海马区的凋亡情况。

2.6 脑片Nissl染色

将“2.5”项下所制得的石蜡切片用尼氏染色液染色10 min，蒸馏水洗2 次，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后中性树胶封片。光学显微镜下观察小鼠海马区神经元的排列与数目以及尼氏小体破碎情况，光学显微镜下观察小鼠海马区的凋亡情况。

2.7 TUNEL检测海马区凋亡

将“2.5”项下所制得的石蜡切片脱蜡，根据TUNEL 试剂盒检测步骤进行检测，荧光显微镜下观察小鼠海马区的凋亡情况。

2.8 蛋白免疫印迹法

行为学测试结束后，快速处死动物并剥取海马组织，PBS 冲洗，迅速冷冻于-80℃冰箱中。称取一定量组织，RIPA 蛋白裂解液提取组织总蛋白，BCA 法测定总蛋白浓度，于98℃，5 min 高温变性。制备10%聚丙烯酰胺凝胶，上样后90 V 2 h 电泳，300 mA 转膜2 h，5% BSA 封闭，一抗（Caspase-3 Antibody、Caspase-9 Antibody、β-actin Monoclonal Antibody），抗体比例1:3000。4℃过夜，孵育二抗（Anti-rabbit IgG），二抗比例1:10 000，室温50min。ECL试剂盒显色。

2.9 统计学处理与数据表示

采用SPSS 19.0 统计软件对实验数据进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。P<0.05 为有差异；P<0.01 为有极显著差异。

3 结果

3.1 开心散联合氟西汀改善抗抑郁效用评价

小鼠CUMS 抑郁模型建立成功后，按照表1 给药方案对动物进行灌胃给药。开心散组给药剂量根据临床常用生药材剂量进行折算；氟西汀低剂量组参照氟西汀临床常用剂量的1/2 进行设置；氟西汀中剂量组参照氟西汀临床常用剂量进行设置；氟西汀高剂量组参照氟西汀临床使用的最高剂量进行设置。

给药后第3 天，测试糖水偏嗜率评价动物抑郁样行为。与空白组小鼠相比，模型组小鼠糖水偏嗜率显著降低（P<0.01）。与模型组小鼠相比，开心散组、氟西汀低剂量组以及中剂量组小鼠的糖水偏嗜率与模型组相比未见显著性差异，氟西汀高剂量组糖水偏嗜率显著升高。联用后，开心散联合氟西汀低剂量组与中剂量组糖水偏嗜率相比模型组显著升高（P<0.05），其中开心散联合氟西汀中剂量组的作用趋势与氟西汀高剂量组相似（P<0.01）。给药第7 天后，与空白组小鼠相比，模型组小鼠糖水偏嗜率显著降低（P<0.01）。与模型组小鼠相比，开心散组、氟西汀中剂量组与高剂量组小鼠糖水偏嗜率显著上升（P<0.05），氟西汀低剂量组仍无显著差异。联合用药组中，开心散联合氟西汀低剂量组小鼠糖水偏嗜率显著提高且效用与氟西汀中剂量组相似（P<0.01）；开心散联合氟西汀中剂量组小鼠糖水偏嗜率显著提高且效用与氟西汀高剂量组相似（P<0.01）。上述结果表明，开心散与氟西汀联用显著改善模型小鼠抑郁样行为，可提升单用氟西汀抗抑郁起效时间，同时可降低氟西汀抗抑郁用量（见图1）。

图1 开心散联合氟西汀对CUMS小鼠行为学的影响（n=7）

3.2 开心散联合氟西汀对小鼠血清中压力应激轴相关因子调控的影响

采用ELISA 法测定小鼠血清中“下丘脑-垂体-海马”压力应激轴（Hypothalamus-Pituitary gland-Adrenal gland，HPA）轴调控因子CRF、ACTH 和Cortisol的表达。与空白组相比，模型组小鼠血清中CRF、ACTH 和Cortisol 的表达显著上升（P<0.01）。与模型组相比，开心散显著下调模型小鼠血清中CRF、ACTH和Cortisol 的表达（P<0.01）；氟西汀低剂量组除下调ACTH 表达外（P<0.05），CRF 与Cortisol 表达未见显著性差异；氟西汀中、高剂量组则显著下调3种压力因子表达（P<0.01）。联合用药组中，开心散联合氟西汀低剂量组显著下调3种压力因子表达且效用接近氟西汀中剂量组（P<0.01）；开心散联合氟西汀中剂量组显著下调3 种压力因子表达且效用接近氟西汀高剂量组（P<0.01），提示其抗抑郁作用可能与抑制压力应激HPA轴激活相关（见图2）。

3.3 开心散联合氟西汀对小鼠下丘脑和海马组织中压力应激轴相关因子调控的影响

采用ELISA 法测定小鼠下丘脑中HPA 轴调控因子CRF和海马中Cortisol的表达。与空白组相比，模型组小鼠CRF 和和Cortisol 的表达显著上升（P<0.01）。与模型组相比，开心散显著下调模型小鼠下丘脑中CRF 和海马中Cortisol 的表达（P<0.01）；氟西汀低剂量组对上述指标表达未见显著性差异，而中剂量与低剂量组可显著下调上述指标（P<0.01）。联合用药组中，开心散联合氟西汀低剂量组可显著下调两种压力因子的表达且效用接近氟西汀中剂量组（P<0.01），开心散联合氟西汀中剂量组具有相似的作用趋势且效用接近氟西汀高剂量组（P<0.01），提示其抗抑郁作用可能与抑制压力应激HPA轴激活相关（见图3）。

图3 开心散联合氟西汀对CUMS小鼠下丘脑和海马压力因子的影响（n=7）

3.4 开心散联合氟西汀对CUMS 小鼠海马组织结构的影响

分离并获取受试动物全脑固定后切片HE 染色后于显微镜下观察开心散与氟西汀联合用药对CUMS小鼠海马组织结构的影响。与空白组相比，模型组小鼠海马齿状回区域细胞排列松散、细胞核固缩、细胞空泡化现象明显，出现明显损伤现象。与模型组相比，氟西汀低剂量组未明显改善上述损伤现象。联合用药组显著改善了上述损伤现象，且开心散联合氟西汀低剂量组效用接近氟西汀中剂量组，开心散联合氟西汀中剂量组效用接近氟西汀高剂量组，提示联合用药具有改善小鼠海马损伤的作用（见图4）。

图4 开心散联合氟西汀对CUMS小鼠海马切片HE染色的影响（n=6）

取切片进行Nissl 染色，镜下观察可以发现，与空白组相比，模型组小鼠的海马齿状回区域细胞排列紊乱，尼氏体显著减少（P<0.05），说明神经元的活力降低。与模型组相比，开心散组与氟西汀低剂量组对尼式体的影响未见显著性；联合用药组显著提高尼式体的数量（P<0.05），且开心散联合氟西汀低剂量组效用优于氟西汀中剂量组，开心散联合氟西汀中剂量组效用优于氟西汀高剂量组，提示联合用药可改善海马神经元损伤（见图5）。

图5 开心散联合氟西汀对CUMS小鼠海马区脑片Nissl染色的影响（n=6）

3.5 开心散联合氟西汀对CUMS 小鼠海马区细胞凋亡的影响

分离并获取受试动物全脑固定后切片TUNEL 染色后于显微镜下观察开心散与氟西汀联合用药对CUMS 小鼠海马区细胞凋亡的影响。与空白组相比，模型组海马区凋亡显著增多（P<0.01）。与模型组相比，开心散显著减少模型动物海马区细胞凋亡（P<0.01）；氟西汀低剂量组具有减少海马区细胞凋亡趋势但未见显著性差异，而其中剂量组与高剂量组具有显著性差异（P<0.01）。联合用药组可显著减少模型动物海马区细胞凋亡（P<0.01），开心散联合氟西汀低剂量组效用接近氟西汀中剂量组，联合氟西汀中剂量组效用则接近氟西汀高剂量组，提示联合用药可抑制慢性压力应激导致的海马区细胞凋亡（见图6）。

图6 开心散联合氟西汀对CUMS小鼠海马区凋亡的影响（n=6）

3.6 开心散联合氟西汀对CUMS 小鼠海马凋亡蛋白表达的影响

分离并获取受试动物海马，采用Western blotting法考察小鼠海马中凋亡蛋白Caspase-9 和Caspase-3的表达。与空白组相比，模型组小鼠海马中Caspase-9 和Caspase-3 的表达显著上升（P<0.01）。与模型组相比，开心散显著下调模型小鼠海马中Caspase-9 和Caspase-3 的表达（P<0.01）；氟西汀低剂量组下调Caspase-9表达（P<0.05）而下调Caspase-3未见显著性差异，其中剂量组与高剂量组均可显著下调两者的表达（P<0.01）。联合用药组中，开心散联合氟西汀低剂量组显著下调两种凋亡蛋白的表达且效用接近氟西汀中剂量组（P<0.01），其联合氟西汀中剂量组下调的效用接近氟西汀高剂量组（P<0.01），提示开心散与氟西汀联合用药可抑制凋亡相关信号通路的激活（见图7）。

图7 开心散联合氟西汀对CUMS模型小鼠海马凋亡蛋白的影响（n=3）

4 讨论

抑郁症的发病原因错综复杂，除最经典的单胺类假说外还有神经炎症、神经营养、神经传导、肠道菌群等诸多诱导因素，这些因素共同作用导致抑郁症的发生发展。其中抑郁患者的神经-内分泌功能的紊乱，尤其是慢性压力应激导致的HPA 轴激活与海马组织凋亡进而导致抑郁情绪的发生是公认的抑郁症病理机制[18-20]。机体处于应激状态时，下丘脑释放促肾上腺皮质激素释放激素（CRH），CRH 刺激垂体分泌ACTH，ACTH 又刺激肾上腺皮质释放糖皮质激素（GC）随体循环入脑。正常人GC水平升高能够通过海马的糖皮质激素受体（Glucocorticoid receptor，GR）对下丘脑与垂体进行负反馈调节，抑制CRH 分泌并抑制HPA 轴过度激活。若HPA 轴持续过度激活则会导致脑内GC 大量堆积，使海马组织细胞凋亡、体积变小，最终导致HPA 轴的负反馈调控机制丧失而产生海马组织损伤。而Ramezani 等[21]使用LONI 概率脑图谱对多个抑郁症患者的脑部影像学数据进行分析，结果发现健康人群和抑郁人群在海马体和左右海马旁回处存在较大的差异。这与本研究中抑郁小鼠的海马区存在结构的变化、神经元中尼氏体的减少和神经元的凋亡等发现相符。

氟西汀是典型的5-HT 再摄取抑制剂，其副作用和不良反应主要有神经与精神系统副作用、消化系统副作用以及性功能障碍，发生率在10%-23%[22]，主要由氟西汀自身抑制5-HT 再摄取的药理特性导致。由于5-HT 的再摄取被氟西汀抑制,突触间隙内5-HT 增多，过度激动5-HT3和5-HT4受体则导致厌食、口干、肠胃胀气、恶心呕吐、便秘、腹泻等消化系统的副作用[23-24]；过度激动5-HT2受体则产生勃起困难、性欲减退或消失、性快感缺失、性高潮延迟或缺失、射精困难等性功能障碍[25]。中药复方治疗抑郁与西药治疗相比具有多靶点、多环节起效的特点，副作用相对较小，因此将中药复方与氟西汀联用以减少氟西汀用量成为临床喜用的抗抑郁用药方式。其中中药开心散作为临床验证有效的治疗轻度与中度抑郁症的抗抑郁经典名方，并且实验研究发现其可以通过增加神经递质与神经营养因子表达，抑制HPA 轴过度激活，调控“脑-肠轴”干预神经元炎性损伤等多种途径发挥抗抑郁作用[26-27]。在本研究中也发现开心散与氟西汀联合用药可以有效抑制慢性压力应激导致的小鼠HPA 轴激活与干预海马凋亡损伤，同时开心散可提升氟西汀抗抑郁起效时间并减少氟西汀的用量，发挥增效作用。

开心散方中药味人参可大补元气、健脾益肺、生津止渴、安神益智，其中人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1均具有强大的神经保护作用[28-29]；茯苓可利水渗湿、健脾和胃、养心安神，其所含三萜类成分茯苓酸具有缓解神经炎症、抗氧化应激[30]的作用；远志镇静催眠、交通心肾，石菖蒲化湿开窍，其中远志口山酮Ⅲ和细辛醚类成分均可显著提高压力应激模型下细胞的存活率，是通过HPA 轴进行调控的重要成分[26,31]；同时孙宇飞[32]通过药代动力学等手段研究发现远志和石菖蒲可以通过中药配伍后的协同作用促进人参与茯苓两味药的治疗效果。在未来的研究中，将深入研究开心散中效用成分与氟西汀联用后增效的作用机制，为中西结合抗抑郁提供更多的科学依据。