高效液相色谱法测定血液透析液中乳酸根的含量

李沅 王翔宇 马金竹 梁慧媛 天津市医疗器械质量监督检验中心 （天津 300384）

内容提要：目的：建立血液透析液中乳酸根的含量测定方法。方法：高效液相色谱法。色谱柱：phenomenex Rezex ROA-Organic Acid（300mm×7.8mm，8μm）；流动相：0.015mol/L硫酸溶液；检测波长：220nm。结果：在0.18～0.72mg/mL范围内，质量浓度与峰面积呈良好的线性关系（r2=1），平均回收率为100.4%，RSD=0.46%（n=9）。结论：该方法简便，准确，重现性好，可用于血液透析液中乳酸根的含量控制。

近年来，国际标准化组织外科植入物分技术委员会（ISO/TC150）针对血液透析设备、浓缩物及透析用水的质量控制建立了一系列标准规范。其中，ISO 13958对血液透析浓缩物的原料、物理、化学及微生物指标都作出了明确的规定。随着国内血液透析技术的不断发展和人民对健康需求的日益提高，血液透析浓缩物的市场也随之扩大。目前，国内有生产透析浓缩物的厂家数十余家，为了规范此类产品的质量，提高产品的市场竞争力，我国也从2003年开始将血透浓缩物的质量监督纳入标准化管理，通过修改采用国际标准ISO 13958制定了我国的医药行业标准YY 0598《血液透析及相关治疗用浓缩物》[1]，行业标准对最终透析液的溶质浓度提出了严格的要求，并提供了相应的试验方法。2023年全国医用体外循环设备标准化技术委员会对YY 0598进行了修订，修改采用ISO 23500-4:2019，将YY 0598变更为0793系列标准[2]。0793分为四个部分，分别为血液透析和相关治疗用水处理设备，血液透析和相关治疗用水，血液透析和相关治疗用浓缩物，血液透析和相关治疗用透析液质量。四个部分将有助于确保血液透析浓缩物和相关材料的有效性和安全性，同时也反映了医护人员、患者、医疗器械制造商和监管机构在血液透析和相关治疗用浓缩物标准相关方面作出的不懈努力。YY 0793与YY 0598最大的差异是增加了联机B干粉的要求及试验方法，明确了离子测试用仲裁方法，所有组方的化学原料应符合《中华人民共和国药典》[3]或国家药品标准的相应要求。血液透析浓缩物指导原则风险管理中提到需要特别关注电解质浓度偏差的风险以及允差控制。

透析过程中的主要治疗作用是电解质和酸碱平衡。为了达到酸碱平衡，通常会通过在配方中加入有机酸的方式调节最终透析液的pH值。常用的有机酸主要为醋酸、枸橼酸和乳酸。冰醋酸本身对人体没有益处，水溶液中呈弱酸性且蚀性强，对眼和鼻有刺激性作用，生产过程冰醋酸强烈的刺激性气味会让人极度不适；乳酸无气味，且乳酸菌能在体内通过繁殖产生代谢活性物质。目前的行业标准YY 0793仅规定了醋酸根离子的测试方法，一直缺乏对乳酸根离子特异性较高的定量测试方法，这就给该类产品的质量控制和市场监管带来了许多实际困难。本试验2013年10月～2014年2月采用了高效液相色谱法测定乳酸根的含量，区别于离子色谱法、分光光度法测定乳酸根的方法，达到定性定量测定的要求[4]。

1.材料与方法

1.1 一般材料

设备与试剂：高效液相色谱仪（美国安捷伦1200型），紫外检测器，乳酸对照品，色谱纯硫酸。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：离子色谱柱（phenomenex Rezex ROA-Organic Acid 300mm×7.8mm，8μm）；流动相：0.015mol/L硫酸溶液；柱温：室温；检测波长：220nm；流速：0.6mL/min；进样量：20μL。

1.2.2 溶液配制

供试品溶液：按照使用说明书规定的稀释比例（A：B：水为1:1.83:43）将A浓缩液、B浓缩液和透析用水混合并摇匀，成为最终透析液。取适量经0.45μm滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

对照品溶液：精密称定，用水制成每1mL 含0.9mg（10mmol/L）的标准储备液。用移液管精密量取2.0、3.0、4.0、6.0、8.0mL储备液至10mL容量瓶，并用透析用水稀释至刻度，摇匀，制得0.18、0.27、0.36、0.54、0.72mg/mL（2、3、4、5、6mmol/L）对照品溶液。

空白溶液：透析用水作为空白溶液。

1.2.3 方法适用性试验

依给定的色谱条件，分别取空白溶液、对照品溶液和供试品溶液各20μL，进样，记录色谱图。

1.2.4 检出限

按照响应值是噪音值3倍，计算乳酸检出限。

1.2.5 定量限

按照响应值是噪音值10倍，计算乳酸定量限。

1.2.6 线性关系

分别取“1.2.2”项下方法配制的对照品溶液，按1.2.1给定的色谱条件进行测定，记录各浓度的色谱峰面积，以峰面积（Y）对溶液浓度（X） 求得回归方程。

1.2.7 精密度试验

称取乳酸对照品适量，加水溶解制成1mL含0.36mg的样品，连续进样6次，每次进样20μL，按上述色谱条件测定，计算RSD值。

1.2.8 重现性试验

取同一批样品按“1.2.2”项下方法配制供试品溶液，连续进样6次，对比平均含量与标示含量。

1.2.9 回收率试验

分别进行乳酸0.18、0.36、0.72mg/mL高、中、低三种浓度回收率的测定，每个样品溶液均按处方量加入其他离子，测定峰面积，计算回收率。

1.2.10 稳定性试验

取重现性项下的供试溶液，分别在0h、2h、4h、12h、16h测定浓度，计算相对标准偏差。

1.2.11 样品含量测定

取批号标示含量4.5mmol/L、标示含量4.5mmol/L、标示含量4.0mmol/L各一份，分别按供试品溶液的制备方法，制备待测溶液。取20μL进样，分别进样3次，测定峰面积，计算含量。按外标法以峰面积计算，样品含量测定结果。

2.结果

2.1 方法适用性试验结果

空白溶液、对照品溶液和供试品溶液高效液相色谱图见图1。乳酸根的保留时间约为6.4min，与其他组分峰的分离度>1.5，理论塔板数为4152。

图1.高效液相色谱图（注：1a.空白溶液；1b.对照品溶液；1c.供试品溶液）

2.2 检出限

按照响应值是噪音值3倍，计算乳酸检出限为36ng。

2.3 定量限

按照响应值是噪音值10倍，计算乳酸定量限为72ng。

2.4 线性关系

以峰面积（Y）对溶液浓度（X）求得回归方程为Y=589020X+494.71(r2=1)，在0.18～0.72mg/mL范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

RSD=0.41%，表明所选定的色谱条件系统稳定。

2.6 重现性试验

连续进样6 次，平均含量为标示含量的101.4%，RSD=0.86%（n=6），表明方法重现性好。

2.7 回收率试验

分别进行乳酸0.18、0.36、0.72mg/mL高、中、低三种浓度回收率的测定，加样回收试验结果见表1。测得平均回收率为100.4%，RSD=0.46%（n=9）。

表1.加样回收试验结果(n=9)

2.8 稳定性试验

取重现性项下的供试溶液，分别在0h、2h、4h、12h、16h测定浓度，计算相对标准偏差RSD=1.81%，表明样品溶液在16h内稳定。

2.9 样品含量测定

样品含量测定结果见表2。

表2.样品含量测定结果(n=3)

3.讨论

慢性肾病是世界范围内危害人类健康的公共卫生问题。全球范围内慢性肾病及其他慢性疾病（主要为糖尿病和高血压）引起的肾衰竭发生率逐年上升，导致终末期肾病患者人数逐年增加，患者只能依赖肾移植和透析治疗来维持正常生命需要的病理性状态。血液透析液是指将患者的血液引出体外，血液在透析器中与透析液通过弥散、对流、吸附和超滤原理对患者进行血液净化治疗，达到清除体内代谢产物，纠正水、电解质及酸碱平衡的目的。临床上用于急、慢性肾功能衰竭及药物或毒物中毒的治疗。透析液由多种成分组成，主要有电解质，钠、钾和钙等，浓度需要根据患者的具体情况进行调整，以确保适当的水平。钠的含量可通过调整氯化钠的添加量来控制，钾的含量则需要根据患者的血液检测结果来进行调整，钙的浓度可以通过添加氯化钙来调节。葡萄糖是为了提供能量给患者的身体细胞，以防止低血糖的发生。葡萄糖的含量通常在透析液中添加5%的葡萄糖溶液。血液中的pH需要控制在合适范围内，以确保透析过程的顺利进行。透析液通过透析过程中的浸透压差和浓度梯度作用，清除体内废物和水分。

本试验待测组分主要有两个色谱峰，分别是干扰峰和乳酸根色谱峰，通过与对照品的对比，可以确定乳酸根的出峰时间约为6min。

利用离子色谱法测定乳酸根，由于透析液中氯离子浓度较高，因此会受到其影响。分光光度测定法，过程繁琐，准确度相对低。通过高效液相色谱法对乳酸含量的测定表明，该方法操作简单易行，重现性和精密度好，测试结果准确。由于利用高效液相色谱法测定透析液中乳酸根含量的测定方法国内尚无，故此研究为保证该产品的质量提供了有价值的测定方法。

血液透析浓缩物作为使用风险最高的三类医疗器械，其质量的好坏直接影响患者的透析效果和生命安全。鉴于我国透析浓缩物生产企业主要分布在天津、广东、江苏、河北和辽宁等地区，生产条件和检验条件参差不齐，推动和贯彻行业标准迫在眉睫。建立统一的检验方法以确保检测结果的准确和产品的安全有效。通过对溶质溶度检测方法学的研究，利用已有的检测手段对行业标准中的参考试验方法进行了充分验证，为行业标准的贯彻和实施提供了强有力的保障，为透析浓缩物检测积累了丰富的经验和数据。

在血液透析治疗过程中，血液透析患者直接暴露于大量透析液中，透析膜是防止有害污染物从透析液中转移至患者体内的唯一屏障。众所周知，制备透析液所用的水及浓缩物内可能存在有害污染物，为了最大限度地减少上述危害，YY 0572[5]和YY 0598对透析液制备用水及浓缩物的质量要求做了相应规定，但如果在制备透析液过程中不够谨慎的话，即使透析液制备用水及浓缩物符合YY0572和YY0598要求，透析液中也可能含有不可接受水平的污染物。所以医护人员对透析设备的维护管理和确保透析用水的质量显得尤为重要。另外超纯透析液的概念应运而生，即细菌含量低于0.1CFU/mL且内毒素含量低于0.03EU/mL的透析液，长期研究显示，使用超纯透析液可降低β2-微球蛋白相关淀粉样变性发生率，更好地保留残余肾功能并改善营养状况[6,7]。

透析液中除考量溶质浓度和微生物污染物，化学污染物建议参考YY 0572的要求，如果无法对YY 0572中所列各种微量元素进行检测，建议对重金属总量进行分析。因为透析制备用水及浓缩物的混合是在独立的透析设备或中央供液系统中完成，这些设备和系统根据要求不能引入化学物质，因此透析液化学污染物限量可以直接参考YY 0572的规定。

随着透析液新时代的到来，溶质浓度的含量因患者不同而不同，配方正从传统的统一固定配方向个体化配方发展，使其达到高质量、高标准、适应个性化患者的要求。钠离子对血管稳定性起到重要作用，从治疗到结束，透析液钠浓度呈现从高到低或从低到高的动态变化，保持透析液中血钠高水平，有利于细胞内水分向细胞外转移，维持血容量稳定。急性肾衰竭时，透析液钾浓度应该个体化。对于少尿期和伴有内出血和广泛血肿的创伤患者，通常使用较低钾浓度的透析液。对于钾摄入量很差、通过呕吐腹泻或大量利尿丢失钾，建议使用高钾透析液，以防止低钾血症。对于大剂量维生素D治疗的患者或因其他原因导致高钙血症的患者，可用低钙浓度透析液。对于严重低钙血症患者，可选用高钙浓度透析液。糖尿病患者使用含糖透析液能避免低血糖反应。与无糖透析液相比，含糖透析液容易被细菌污染。个性化透析液能满足合理透析及患者最舒适的要求。