轮状病毒的检测方法及综合防控

文｜李群杰（山东省寿光市羊口镇畜牧兽医工作站）

轮状病毒（PORV）是导致仔猪腹泻的重要病原体之一。它能够引起多种小动物和新生婴儿腹泻，主要通过粪便和口腔传播。临床上常表现为腹泻、食欲不振甚至消瘦和嗜睡等症状。随着规模化猪场的兴起，世界上许多国家和地区都发现了轮状病毒导致的相关腹泻疾病，对养猪业的发展产生了严重影响，并造成了巨大的经济损失。因此，采用快速准确的检测方法对该疫病进行防控和治疗至关重要。笔者对猪源轮状病毒检测方法的研究进展进行了综述，总结了已有的猪源轮状病毒检测方法的原理、优缺点等，以期为临床上轮状病毒的防治提供重要指导。

一、病原学

猪轮状病毒（Porcine Rotavirus，RV）属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，其基因编码了一种结构蛋白和5种非结构蛋白。全球范围内，猪轮状病毒广泛流行，且没有明显的季节性规律，猪场的患病率高达74%。根据轮状病毒结构蛋白VP6的氨基酸序列，轮状病毒可以分为9组（RVARVD和RVF-RVJ）。其中，RVA、RVB、RVC和RVH四组对人和猪都具有致病性。猪A组轮状病毒（RVA）和C组轮状病毒（RVC）是新生仔猪中最常见的病原体，其中RVC的致死率可达100%。RVA是主要的轮状病毒群，有多种基因型可引起猪腹泻。与RVA类似，RVC也能感染多种动物，尤其在新生仔猪中患病率较高。最近的研究表明，猪RVC毒株的某些基因（如VP6或nsP4）与人RVC毒株具有相似性，存在可能发生人畜共患病的情况。由于轮状病毒的血清型较多，目前还没有特效的治疗方法。猪轮状病毒和猪冠状病毒的传播对公共卫生和畜牧业产生了巨大威胁。因此，对于轮状病毒的暴发和流行，及时准确地检测和鉴别该病毒对于采取更有效的防治措施具有重要意义。目前常用的猪轮状病毒检测方法包括传统经典检测方法、免疫学方法和分子生物学方法。传统经典检测方法主要基于电镜技术和病毒分离培养技术。然而，电镜技术设备昂贵且操作烦琐，不适合大规模的临床检测。此外，病原检测涉及复杂的病料处理流程，如细菌培养、动物组织和血清处理等，受到其他病原体的影响，病原检测的敏感性较低。病毒分离培养是病原检测过程中必不可少的步骤，但由于病毒分离存在一定的不确定性，因此不适合大规模临床检测。目前，酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是轮状病毒检测常用的方法。其中，ELISA是世界卫生组织（World Health Organization，WHO）推荐使用的标准检测诊断轮状病毒的方法。ELISA利用抗体与病毒特定蛋白结合的原理，通过颜色反应来检测病毒的存在。PCR则通过扩增目标病毒的核酸序列来进行检测，具有高度的敏感性和特异性。

二、猪轮状病毒ELISA检测方法

ELISA技术具有操作简单、敏感性高、特异性强、重复性好和价格低廉等优点。目前，在国内已经建立了以猪轮状病毒VP6和VP7蛋白为抗原的间接ELISA方法来检测猪轮状病毒血清抗体。研究人员使用纯化的猪轮状病毒VP6蛋白作为检测抗原，建立了快速、特异、敏感的间接ELISA方法，为临床上预防和治疗猪轮状病毒提供了一种有效的技术手段。此外，研究人员还开展了双抗体夹心ELISA检测方法来检测猪轮状病毒血清抗体。他们使用纯化的兔抗PRV抗血清作为包被抗体，利用2B3杂交瘤细胞培养上清作为检测抗体。该方法在检测猪轮状病毒时与PEDV、TGEV和PRV没有交叉反应，并具有良好的稳定性。与RT-PCR方法相比，该方法的准确性达到了95.7%。尽管ELISA方法具有操作简练、价格低廉等优点，但仍存在一些局限性。例如，它不能够进行定量检测，在临界值附近时无法判断结果。

三、猪轮状病毒分子生物学技术方法

逆转录-聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）是一种目前在RV病毒检测中具有高特异性的方法。它的操作简单，可以扩增产物用于后续的克隆和测序等研究。然而，与病毒培养相比，该方法不能够准确地定量目标病毒。此外，在操作过程中，判断反应结果需要进行电泳，这会延长操作时间。而且，操作过程中可能会发生污染，并且人工判断结果时存在误判的可能性。因此，为了提高检测效率和准确性，许多学者对RT-PCR的实验原理进行了进一步的优化。

1.一步法RT-PCR。RT-PCR试验可以使用一步法和两步法进行。一步法RT-PCR技术是在同一个缓冲液和酶系中进行cDNA合成和PCR扩增，无需建立cDNA文库，即可获得少量的mRNA。这种方法省去了中间步骤，简化了实验流程。两步法RTPCR是通过逆转录酶对cDNA进行合成，并将合成的cDNA作为PCR的模板，将RNA的逆转录和PCR扩增分为两个步骤。科研人员使用NSP4作为目标基因设计引物，开发了一种基于一步法的RT-PCR技术。与传统的RT-PCR技术相比，这种方法具有简便、高效、快速、灵敏度高、特异性高和稳定性高等优点。与两步法相比，一步法具有以下优点：首先，操作简便只需1～2小时；其次，反应快速，只需15分钟即可完成；此外，使用非核酸模板（如生物素）而不是核酸模板（如PCR产物），可以降低污染的风险；再者，一步法对RNA的二级结构影响较小，因为RNA的二级结构变化主要出现在3'端或5'端，一步法可以减少RNA二级结构的变化；最后，由于在逆转录过程中进行了纯化，一步法可以降低由引物和模板不匹配引起的PCR错误率。综上所述，一步法RT-PCR具有简单操作、快速、低污染、对RNA二级结构影响小和PCR错误率低等优点，是一种有效的RT-PCR技术。

2.实时荧光定量PCR。荧光定量PCR是一种广泛应用的病毒检测方法，与传统PCR相比，它具有更高的灵敏度、更强的特异性，并且具有高度的自动化程度，对环境没有污染，能够实时监测反应进程，并且可以进行多样的检测反应，所得结果准确可靠。荧光定量PCR技术主要包括探针法和SYBR Green I染料法。科学家选择了VP6基因用于引物设计，通过使用FAM、Texas Red、CY5和VIC这四种不同的信号波长，建立了基于TaqMan探针的多重实时荧光定量PCR方法，可用于检测和区分猪流行性腹泻病毒的G1和G2亚型，以及猪轮状病毒的A和C群。该方法具有高度的特异性，因为四种信号波长不同，不会相互干扰，可以在同一反应管中同时检测多个荧光信号。这种方法减少了检测时间和成本，为多种猪腹泻病毒的快速、灵敏和特异性检测提供了有效的工具。该多重实时荧光定量PCR可以作为猪病毒性腹泻病的早期筛查工具、流行病学研究以及腹泻病毒传播的监测。另外，高等科学家利用VP6基因保守区域设计引物，建立了一种使用SYBR Green I染料的实时荧光定量PCR方法，用于检测猪A组轮状病毒。与探针法相比，染料法的特异性更高、敏感性更强，但如果探针区域发生变异，可能会导致假阴性结果。针对容易发生变异的区域，采用多个探针可以避免这个缺陷，但是探针的设计、标记和纯化成本较高。而科学家开发的基于SYBR Green I染料的实时荧光定量PCR方法成本较低，只需设计特异性引物即可进行病毒拷贝数的检测，而且比普通PCR方法具有更高的敏感性，重复性也良好，批内和批间变异系数均小于2%，表明该方法具有较高的稳定性，非常适合临床上大规模检测。

3.环介导等温扩增检测方法。

科研人员利用环介导等温扩增技术（LAMP）开发了一种快速检测轮状病毒的方法。该方法利用具有链置换功能的BST DNA聚合酶，在60～65℃的恒定温度下扩增目标序列。这种技术的原理是在固定温度条件下，引物与模板形成氢键，从而只需进行恒温反应即可获得目标条带，无需进行模板热变性、温度循环、跑电泳和UV观察等步骤。该反应体系中只有模板和引物参与反应，使整个过程简化且省去了复杂的PCR步骤。与传统的RT-PCR相比，这种方法节省了时间，提高了效率，因为无需进行模板热变性、温度循环、跑电泳和UV观察等步骤。此外，所需仪器简单，易于在临床应用中使用。这种方法的优势在于减少了实验操作的复杂性，为快速、高效的病毒检测提供了一种新的选择。

四、综合防治

猪轮状病毒具有季节性发生和流行的特点，多在冬春季发病较多。它以地方性或散在流行的方式传播，影响各个发育阶段的猪只。病症主要表现为严重腹泻、呕吐、脱水、食欲不振和低精神状态。特别是对于哺乳仔猪和断奶仔猪，其危害更为严重，影响它们的正常生长发育，同时也给养殖场造成巨大经济损失。

猪轮状病毒主要通过患病猪和潜伏感染猪传播，主要途径是粪-口传播，即病猪排泄的粪便可污染饲料和饮用水，从而成为主要的传播途径。为了应对这个问题，建议在日常养殖过程中采取以下措施：对患病猪进行隔离，一旦发现疑似病例，立即将其隔离，以切断传染源并保护易感动物免受病原体感染。对病猪的饲养工具和饲养场地进行全面的消毒，以切断传播途径。改善环境卫生状况，定期清洁和消毒养殖环境，每天进行消毒连续一周。确保饲料不受污染且营养丰富，这样可以提高猪只的免疫力和抵抗力，预防不良诱因。对于仔猪，应按照规定的疫苗免疫程序进行接种，并及时进行补种，确保养殖动物达到预定的抗体水平。

综上所述，猪轮状病毒是一种传播广泛且危害严重的病毒性传染病。目前存在多种检测以及针对该病的治疗和预防方法。因此，养殖管理人员应高度重视病毒的卫生环境消毒，制定全面的防控措施，及时切断病毒传播途径，减少病原体存活的机会，确保养殖动物的健康生长。