再生障碍性贫血诊断标志物研究进展

胡子然 陈涛 李哲媛 张晓琳 林欣 蔡凌翼 于小凡 贾晓宇 李苁洲 王金环

再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)是一种以造血细胞谱系减少,主要以全血细胞减少为特征的骨髓造血衰竭疾病(bone marrow failure,BMF),主要分为先天性和获得性两大类,先天性AA发病率低,其中绝大多数患者属于原发性获得性AA[1]。本病的病因及发病机制未明,其致病因素主要包括化学或物理损伤(包括药毒性和辐射)、遗传缺陷以及免疫介导异常[2]。细胞毒性T淋巴细胞分化异常、功能亢进所致造血干细胞和祖细胞显著减少是AA的主要发病机制[3]。AA在我国的年发病率约为0.74/10万,高于世界平均水平2～3倍,可发生于各年龄段,但好发于青壮年(15～25岁)以及老年群体(65～69岁),且无明显性别差异[4]。一部分AA患者会并发高危的血细胞减少症,约15%的患者会发展为骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes,MDS)或急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML);重型AA患者(severe aplastic anemia,SAA)如果缺乏有效的治疗,2年存活率只有30%左右,严重影响AA患者的生存质量与生存率[5-8]。因此,AA对患者带来的不良后果与预后导致临床迫切需要一种简便、易耐受、高效的检测方法,但目前AA的诊断仍仅局限于排除性诊断,精确的诊断标准和诊断标志物成为影响该病患者治疗与预后的关键因素之一。一些新发现的蛋白质或miRNA分子为AA的诊断及分期提供了更加科学高效的支持。特别是运用一些灵敏且准确的蛋白质生物标志物作为检测指标,可以更好地进行AA的诊断、治疗方案的选取以及预后的判定。本研究将对AA的诊断标志物进行综述,以期为诊断及治疗提供新的思路。

1 外周血生物标志物

1.1 抗COX-2自身抗体(Anti-COX-2 autoantibody) Kelkka等[2]发现了一种与健康对照组差异倍数>20的免疫性再生障碍性贫血(immune aplastic anemia,IAA)限制性自身抗体蛋白Anti-COX-2 autoantibody(aCOX-2 ab)。随后他们在一个包括405例IAA患者、815例健康对照的试验中发现,以ROC曲线转折点为阳性阈值的情况下,37%的成年IAA患者aCOX-2 ab阳性表达,同时阳性患者血小板计数水平更低,aCOX-2 ab阳性与诊断时的血小板计数之间也存在统计学相关性(OR=1.34)。aCOX-2 ab在HLA-DRB1*15∶01阳性患者中表现出了高特异性与高敏感度[2]。这意味着二者可能共同确定了一种类型的IAA,尽管相关机制尚未明了。同时已有研究表明HLA-DRB1*15∶01阳性的AA患者对环孢素A的治疗更为敏感,疗效更加显著,环孢素A也因为其相对低廉的治疗成本及较少的不良反应在国内应用最为广泛[9-10]。免疫抑制疗法(immunosuppressive therapy,IST)或者艾曲泊帕等生长因子受体激动剂的治疗效果并未在aCOX-2 ab阳性与阴性患者之间显示出差异性,但由于aCOX-2 ab阳性患者的样本量仅13例,且中位年龄较小,因此还需继续验证[2]。相比较于骨髓活检以及骨髓穿刺,解离增强镧系元素荥光免疫检测(DELFIA)检测所需的血清样本采集更加简便且更易耐受。aCOX-2 ab联合HLA-DRB1*15∶01是较为理想的AA诊断指标组合,对AA的筛查具有良好的临床应用价值,同时该标志物的高敏感度与特异性也为解决鉴别AA与其他BMF的长久困难提供新的方向。

1.2 循环Dickkopf-1(DKK1)蛋白 Giudice等[11]使用SOMAscan技术筛选了28例AA患者治疗前后的血清蛋白,以及7例接受标准IST治疗和TPO受体激动剂治疗的SAA患者的血浆蛋白,总共发现了有希望成为AA诊断或者预后指标的19种血清蛋白和28种血浆蛋白。为了确认该结果的普遍性,他们采集了65例SAA患者在接受治疗前、IST 6个月、IST1年的血清样本进行Luminex检测,基于AA的发病相关性选择其中以Dickkopf-1(DKK1)为代表的4种蛋白进行验证。根据患者预后情况分为完全缓解组、部分缓解组以及无缓解组,ANOVA分析显示:完全缓解组血清DKK1蛋白水平在治疗前、IST 6个月以及1年后显著高于其他2组。通过非配对T检验发现,DKK1蛋白在完全缓解组与无缓解组之间的特异性比其他3种蛋白更为显著。将1年的随访数据生成Logistic回归和广义线性模型以预测IST预后情况,把患者治疗前和IST 6个月的数据应用于该函数得到:以DKK1蛋白水平为代表的数学模型对治疗前的患者反应性的预测敏感度为48%、特异度达到82%,而在治疗6个月时的预测敏感度可达76%、特异度为83%,与实际结果对比准确率为79%[11]。血小板是循环DKK1蛋白产生的主要来源[12]。Giudice等[11]发现AA患者血清循环DKK1蛋白水平低于正常对照组1.5倍的现象也在一定程度解释了AA患者血小板计数下降的问题。DKK1蛋白在血液系统疾病中的相关研究较少,此次发现可能也预示了其在AA等免疫介导异常所致的血液病中的诊疗潜力。血清DKK1对于提高AA的诊断检出率有一定帮助,其在预测IST疗效表现出了高敏感度和特异度,为AA预后的预测提供了新方向。虽然缺少DKK1蛋白预测模型在其他AA治疗方式中的研究比对,但综合已有研究也可发现,DKK1蛋白对临床治疗方案的选取仍具有一定的参考价值。

1.3 Component 1q(1Q) C1q是补体经典途径C1的一个亚基,它可调节各种免疫细胞,不仅参与启动机体抵御病原体的第一道防线,而且在固有免疫和特异性免疫过程中发挥主要的枢纽作用[13]。Ding等[14]发现,134种蛋白质在NSAA患者和正常对照之间存在差异表达,而C1q差异表达更为显著。他们之后通过酶联免疫吸附测定测定40例治疗前NSAA患者、40例缓解期NSAA患者、20例SAA患者、20例特发性血小板减少性紫癜患者和20例自身免疫性溶血性贫血患者以及20例健康个体血清样本C1q浓度证实:NSAA组血清C1q水平在治疗前明显低于正常对照组以及缓解期NSAA组。此外,NSAA组血清C1q水平低于SAA组,但是SAA组、正常对照组和缓解期NSAA组血清C1q水平差异无统计学意义。为更好了解C1q的临床临床意义,将血清C1q水平与NSAA临床指标包括血细胞计数和免疫指标进行相关性分析,血清C1q浓度与粒细胞计数、血红蛋白含量、血小板计数和网织红细胞比率呈正相关。此外,血清C1q浓度与mDC/pDC比值呈正相关与CD4/CD8比值呈负相关。这些结果表明,补体途径在AA的免疫发病机制中起到重要作用。C1q在SAA与NSAA的差异表达,为疾病严重程度的判定提供了一个新的可靠生物标志物。虽然运用酶联免疫吸附测定进行血清C1q检测是简便高效的,但是C1q水平变化是否具有临床诊疗价值,仍然需要大量的相关研究来验证。

1.4 细胞毒T淋巴细胞抗原-4(Cytotoxic T lymphocyte antigen 4,CTLA-4) 调节性T淋巴细胞(Treg)是一类具有免疫抑制功能的T淋巴细胞亚群,Treg的免疫调节功能主要通过抑制T细胞增值,以及细胞因子和自身抗体的产生来表现。同时,它可调节树突状细胞(DC细胞)、单核巨噬细胞以及NK细胞的功能。既往研究显示,AA患者的Treg细胞含量低于正常人,且功能缺损,分泌细胞因子的非Treg增加[15]。在SAA患者群中,Treg数量普遍低于NSAA患者,但在IST后数量可有恢复,这提示Treg具有用于疾病的诊断、严重程度的分析以及预后监测的潜力。目前已知SAA发病机制是髓样树突状细胞(myeloid dendritic cell,mDC)被某些未知抗原激活,使其抗原呈递异常,产生大量Ⅰ型淋巴细胞因子,激活CD8+T细胞,从而导致骨髓造血衰竭。而DC的主要调节靶点是Treg细胞,且此过程主要依赖于抗原刺激[16]。Liu等[17]实验结果显示Treg细胞表面上的CTLA-4表达与mDCs表面上的HLA-DQ表达呈负相关。该结果表明,SAA患者外周血中Treg数目和CTLA-4表达减少,并且mDC的异常活化可能是由于mDC上的MHCⅡ类分子抗原呈递异常引起的,从而启动了一系列的免疫细胞活化,Treg对mDCs的调节作用通过CTLA-4与HLA-DQ共同实现。结合AA临床免疫细胞分析,SAA患者外周血Treg细胞表面CTLA-4表达与NK细胞数、CD4+T/CD8+T比值呈正相关,与CD8+T细胞数呈负相关;mDC表面HLA-DQ表达与外周血Treg细胞数、NK细胞数、CD4+T/CD8+T比值呈负相关。目前已有学者将CTLA-4单克隆抗体作为SAA等自身免疫性疾病治疗靶点进行研究,而该抗体已用于肿瘤临床治疗中且取得了良好的疗效[18]。以上结果证实CTLA-4水平与SAA相关临床指标的显著相关性,为IST疗效提升及疾病复发监测的研究提供了思路;同时,mDC上的MHCⅡ类分子HLA-DQ调节机制可能揭示了Treg细胞的作用靶点。

2 基于分子水平的诊断指标

2.1 miRNA分子 miRNA是一组内生的非编码小分子RNA,一般含有18～25个核苷酸。Xiao等[19]提出miRNA对于调节免疫具有重要作用。miRNA也可存在于细胞外如微泡、外来体和微粒中。这些循环miRNA可以在血清、血浆、尿液和唾液中被检测和定量[20]。循环miRNA可反映机体的生理和病理状况,并且具有高度稳定性,这使其具有充当各种疾病的生物标志物的能力[21]。Hosokawa等[22]在AA患者血浆中发现3种比例失调的miRNA且与正常人群相比差异倍数>1.5倍,其中miR-150-5p、miR 146-5p比例上调,miR-1比例下调,同时在患者接受IST后,三者比例向正常水平回归。但是miR-150-5p仅在治疗有效的患者间显著降低,而无论IST对患者是否有效,miR-1水平均会上升。并且他们发现,在AA与MDS患者之间存在5种差异明显的miRNA(miR-150-5p、miR-146-5p、miR-1、miR-22-3p和miR-424-5p),这些miRNA分子具有继续研究以鉴别AA与MDS的价值。Hosokawa等[22]提出了一种新的检查方式以提高AA诊断阳性率并且监测AA对IST的反应,也为未来揭示疾病发展中相关循环miRNA的潜在作用机制,以及其与IST关联性提供思路。该研究也反映了体液检查在鉴别AA和MDS中的应用与研究价值,体液检查由于具备患者易耐受的特点,因此也更好在临床中推广。

2.2 RNA拷贝数 Wilms tumor 1(WT1)是一种肿瘤抑制基因,可识别间皮细胞增生、恶性间皮瘤、卵巢囊腺癌、性腺母细胞瘤、肾母细胞瘤及结缔组织增生性小圆细胞肿瘤,在血液恶性肿瘤和其他肿瘤患者的未成熟胚细胞中过表达[23-25]。Ishiyama等[26]发现,WT1基因在获得性AA患者外周血中表达增加,随后用定量PCR(聚合酶链反应)试剂盒对63例AA患者和5例MDS患者的WT1拷贝数(/μgRNA)进行连续测量,首次测量时,41%未接受治疗的AA患者WT1阳性表达,而59%的正在接受治疗的患者体内WT1基因呈阳性,之后2～105个月的随访发现,大多数AA患者的WT1拷贝数逐渐增加,但只有3例AA患者WT1拷贝数的最大变化率>20.0(WT1拷贝数的最大值与首次测量的WT1拷贝数的比值),并且这3例患者分别在第2、46和105个月时并发骨髓增生异常综合征。MDS患者的WT拷贝数690～5 700(中位数2 000)一直保持较高水平,而在大多数拷贝数>50WT1阳性AA患者中,WT1基因主要在粒细胞富集而非单核细胞中。这提示AA患者体内WT1拷贝数持续增加可能是由于粒细胞中WT1基因表达增加。实验表明,在缓解期AA患者中,WT1拷贝数变化率>20.0的患者可能会有发生MDS的风险,需要审慎监测[27]。虽然该实验中发展为MDS/AML的AA患者的WT1拷贝数变化率高达20.0,但由于AA患者的观察期(中位数46个月)可能不足以进行病情演变,一些WT1拷贝数中等偏高的患者在较长的观察期后可能存在病情变化的潜在风险。目前AA和低增生MDS之间很难鉴别[27]。如果在早期检查骨髓,则诊断为AA;如果出现某些克隆的情况下进行检查,诊断将是MDS[28]。而WT1拷贝数变化率发现为AA与MDS相关发病机制的分子水平研究提供了新的方向。通过PCR监测AA患者体内的WT1数变化率有可能成为预测AA转归的生物标志物。

3 基于骨髓的检验诊断

在既往研究中,B10细胞对炎症、自身免疫疾病和癌症的免疫调节作用引起了广泛关注[29-31]。Gu等[32]收集24例SAA患者、14例NSAA患者和20例正常人的骨髓后用淋巴细胞培养基分离出单核细胞进行体外培养并刺激细胞,随后通过流式细胞术分离出细胞,免疫荧光双标记测定IL-10与CD19的比值并以此来反映B10细胞及B10祖细胞在B细胞中的比例。有实验结果表明,与健康对照组相比AA患者骨髓中B10细胞和B10祖细胞在CD19+B细胞中的比例降低,而SAA组骨髓B10细胞和B10祖细胞在CD19+B细胞显著低于NSAA组,同时B10细胞比例与反映骨髓增生严重程度的临床血液指标如周血中性粒细胞、网织红细胞和血小板计数之间呈正相关,B10细胞水平越低,也意味着疾病越严重[1]。尽管B10细胞用于AA诊断的高效性与特异性还需在大样本实验中进一步探索,但是其与AA严重程度的相关性揭示了B10细胞的负性免疫调节在AA发病机制中的重要作用。郝立君等[33]报道了B10细胞影响免疫性血小板减少症的发展和免疫调节,但是其在AA中的潜在作用机制以及作用靶点尚不清楚。聂甜等[34]的研究证实,再生胶囊可能通过促进AA大鼠外周血IL-10和TGF-β1水平的提高达到促进AA大鼠恢复骨髓造血的功能。B10细胞水平的干预是否有助于AA的治疗,值得后期的进一步研究。

综上所述,AA是临床较为常见的骨髓造血功能衰竭性疾病。在AA的诊断方法中,血常规检查应用最为普遍,也是先行诊断采取的方式,患者血红蛋白、血小板及白细胞的数目明显低于正常指数则提示AA,但该诊断方式不够精确,容易出现漏诊以及误诊[35]。骨髓相关检查权威且可靠,它能最直观地反映患者的骨髓造血情况,提高AA诊断的阳性率,至今仍然是一项重要的诊断方法。将传统的诊断方法与前沿生物技术联合能较大提高AA的诊断效率以及准确性。对于占绝大多数AA比例的IAA患者群体,aCOX-2 ab表现出了高度的敏感度及差异性,具有成为临床诊断标志物的潜力,且运用现存的诊断技术检验该项指标是简便且高效的,对于临床应用及推广具有很高的价值。随着表观遗传学在各种疾病的诊断以及预后中不断推广,miRNA的差异表达等表观学的改变也越来越受到重视,其在AA的诊断、鉴别及治疗中的监测取得了良好的效果。但目前为止,患者依然未发现针对全部或者部分AA群体百分之百准确且特异的诊断标志物,联合多种指标进行诊断疾病或许是未来精准检测AA以及鉴别AA与其他BMF疾病的重要方式。针对AA发病机制的研究,以及探索各个指标在AA发病过程中的潜在免疫功能,仍然是未来研究的一大热点。