基于色谱指纹图谱技术的小粒种咖啡质量控制方法

单治国　马剑　满红平　刘丽　张春花

小粒种咖啡是指咖啡豆粒径较小、产量较低的咖啡品种，主要分布于非洲、亚洲、南美洲等地区。由于生长环境、种植条件、加工工艺等方面的差异，小粒种咖啡的品质也存在着较大的差异，因此，建立一种全面、客观、有效的咖啡品质控制方法，对于保障小粒种咖啡的品质和消费者利益具有重要意义。

色谱指纹图谱技术是一种以色谱为基础，结合指纹图谱的理念，对复杂样品进行全面、准确分析的方法，具有高分辨率、高灵敏度、高重复性等优点，被广泛应用于食品、药品等领域的质量控制中。近年来，有研究者将化学指纹图谱技术应用于咖啡品质控制中，通过比较不同咖啡样品的色谱图，可以对咖啡中的化学成分进行分析和比较。本文旨在探讨基于色谱指纹图谱技术的小粒种咖啡质量控制方法，以期为提高小粒种咖啡品质提供理论依据和实践指导。

一、仪器与试剂

1.主要仪器。高效液相色谱仪，型号为Agilent100；色谱柱，型号为ODS，规格为5μm；1/1万电子分析天平，型号为BP135S；1/10万电子分析天平，型号为BP33S；数控超声波清洗器，型号为KG-250OE；电热恒温水浴锅，型号为XNCF-3000。

2.试剂和样品。试剂：甲醇、乙腈、甲酸、磷酸、磷酸二氢钠，甲醇和乙腈为色谱纯，其余均为分析纯。小粒种咖啡实验用对照品：咖啡酸（质量分数为99.7%）、阿魏酸、木犀草素、单咖啡酞。实验用水：娃哈哈纯净水。10批小粒种咖啡样品：5批（S1-S5）为小粒种咖啡，4批（Z1-Z4）为混伪品野生小粒种咖啡，1批（R）为优异小粒种咖啡。10批次样品均用封口袋盛装，置于干燥器中备用。

二、实验与方法

1.对照品溶液的制备。咖啡酸、阿魏酸、木犀草素和单咖啡酞各称取0.5g置于5mL量瓶中，向其中添加甲醇，使样品完全溶解。依次制得质量浓度为0.7856mg/mL、0.9085mg/mL、0.8511mg/mL、0.2182mg/mL的标准溶液。吸取以上四个标准品各2mL于10mL容量瓶中，用甲醇稀释，定容，混合均匀，制得咖啡酸为0.1571mg/mL、阿魏酸为0.1817mg/mL、木犀草素为0.4256mg/mL、单咖啡酞为0.0218mg/mL。

2.供试品溶液的制备。将10批小粒种咖啡试样粉碎成粉后过四号筛，各取0.5g放入10个有塞的锥形瓶中，加入甲醇，将其定容到5mL容量瓶中。在100kHz下超声波萃取40min，在室温下冷却，用0.45mm的微孔滤膜过滤，取出滤液，最后得到浓度为0.69mg/mL的供试品溶液。

3.色谱条件。采用梯度洗脱方法进行洗脱，所使用的流动相为0.1%甲醇（A）和乙腈（B），柱温为250℃，流速为1.0mL/min，检测波长为360nm，进样量为10μL。

4.建立小粒种咖啡色谱指纹图谱。制备10批小粒种咖啡溶液，利用高效液相色谱仪对其进行色谱分析，生成小粒种咖啡色谱图。将获得的色谱信息输入到指纹图谱评估体系，以小粒种咖啡R批为基准，设定时间窗口宽度0.1min，采用中值方法进行多点修正，得到指纹图谱。

5.小粒种咖啡含量测定。通过高效液相色谱法生成小粒种咖啡的指纹图谱后，仍然无法有效区分小粒种咖啡与混伪品野生小粒种咖啡，因此需要对两者指纹图谱中指认的4个共有成分进行含量测定，为小粒种咖啡的质量控制提供依据。

（1）线性关系。每次选取5μL，以待测化合物的峰面积和对照品的浓度进行线性回归，前者为纵坐标，后者为横坐标，通过逐渐增加对照品溶液的浓度，记录峰面积和浓度数据，运用线性回归分析确定峰面积和浓度之间的线性关系，最终确定保持良好直线性质的浓度范围，据此得到各成分的标准曲线，如表1所示。由表1可知，各成分之间的线性关系良好，可进行后续操作。

（2）含量测定。将所需要的咖啡酸、阿魏酸、木犀草素和单咖啡酞4种成分的含量作为变量，测定5批小粒种咖啡和4批混伪品野生小粒种咖啡。以9批小粒种咖啡样品和9个共有峰的峰面积为变量，利用组间连接法对样品进行CA，结果见图1。利用主成分分析（PCA）将9批小粒种咖啡样品的共有峰峰面积进行标准化处理，在此基础上，以所测各成分的含量作为自变量，利用各成分间的线性关系对各成分进行主成分分析。

三、结果与分析

1.指纹图谱结果分析。10批小粒种咖啡样品的对照色谱指纹图谱如图2所示。由图2可知，R为小粒种咖啡对照图谱，最终确定了9个共有峰。对比对照品溶液的色谱图，在色谱指纹图谱共有峰中共指认出4个成分，2号峰为咖啡酸、4号峰为阿魏酸、5号峰为木犀草素、7号峰为单咖啡酞。综合发现，本次实验选取的小粒种咖啡和优良小粒种咖啡色谱图大体上相似。

2.相似度结果分析。当相似度越接近1，说明两个色谱越相似。将对照图谱与10批小粒种咖啡样品的色谱指纹图谱进行相似度分析，结果见表2。由表2可知，小粒种咖啡相似度均大于0.940，表明本次实验选取的小粒种咖啡与优良小粒种咖啡的差异性不大，证明本次实验选取的小粒种咖啡质量好，建立的色谱指纹图谱方法可用于小粒种咖啡的鉴别和整体的质量控制。

3.含量测定结果分析。小粒种咖啡样品的PCA得分图如图3所示。由图3可知，5批小粒种咖啡和4批混偽品野生小粒种咖啡均含有咖啡酸、阿魏酸、木犀草素、单咖啡酞，对比两者中的咖啡酸含量发现，小粒种咖啡所含咖啡酸的含量普遍高于混伪品野生小粒种咖啡，因此可以通过比较咖啡酸的含量，较好地区分小粒种咖啡和混伪品野生小粒种咖啡。

综上所述，本研究所建立的基于色谱指纹图谱技术的小粒种咖啡质量控制方法，不仅简便、准确，还能进行定性和定量双重分析，为小粒种咖啡的质量评价提供了参考依据。

基金项目：2022年度普洱市科技局普洱学院咖啡研究专项（2022KFZX03）。

作者简介：单治国（1979-），男，汉族，山东兖州人，副教授，博士，主要研究方向为茶叶与咖啡科学技术。

张春花（1984-），女，彝族，云南泸西人，副教授，博士，主要研究方向为茶叶与咖啡科学技术。