基于PPARγ/Nrf2信号通路探讨头穴透刺对脑出血大鼠血肿清除的影响

许文婷 孔莹 薛玉满

摘要 目的：基于過氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）/核因子E2相关因子2（Nrf2）信号通路探讨头穴透刺对脑出血大鼠血肿清除的影响。方法：将160只雄性SD大鼠分为空白组、假手术组（颅内注射生理盐水）、模型组（脑出血模型）及干预组（脑出血模型＋头穴透刺治疗），每组40只。造模后3 d及头穴透刺治疗结束后检测各组大鼠神经功能、脑组织液中血红蛋白（Hb）及一氧化氮（NO）含量、脑组织中Nrf2、CD36蛋白及mRNA表达量；观察各组脑血肿周围微血管分布并计算微血管直径及密度指数。结果：与假手术组比较，造模后3 d干预组与模型组脑组织Hb及NO水平升高，Nrf2、CD36蛋白及mRNA表达均降低，微血管直径及微血管密度指数均减小（P＜0.05）。与造模后3 d比较，治疗结束后干预组神经功能评分、微血管直径及微血管密度指数升高，Nrf2、CD36蛋白及mRNA表达降低，且优于模型组（P＜0.05）；干预组Hb及NO水平降低，且低于模型组（P＜0.05）。干预组与假手术组治疗后微血管直径及微血管密度指数比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：头穴透刺可促进脑出血大鼠脑组织Nrf2、CD36蛋白及mRNA表达，降低脑组织Hb及NO水平，改善血肿周围微血管血流状态，对脑血肿清除有促进作用。

关键词 脑出血；脑血肿清除；过氧化物酶体增殖物激活受体γ/核因子E2相关因子2信号通路；头穴透刺；大鼠；实验研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.05.011

The Effect of Scalp Acupuncture on Hematoma Clearance in Rats with Cerebral Hemorrhage Based on PPARγ/Nrf2 Signaling Pathway

XU Wenting， KONG Ying， XUE Yuman

Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， Heilongjiang， China; Second Affiliated Hospital， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150001， Heilongjiang， China

Corresponding Author XUE Yuman， E-mail： xueyuman@163.com

Abstract Objective：To investigate the effect of scalp acupuncture on hematoma clearance in rats with cerebral hemorrhage based on the peroxisome proliferator-activated receptor γ（PPARγ）/nuclear factor E2 associated factor 2（Nrf2） signaling pathway.Methods：One hundred and sixty male SD rats were divided into blank group，sham group（intracranial injection of physiological pressure water），model group（intracerebral hemorrhage model） and intervention group（intracerebral hemorrhage model＋scalp acupuncture treatment），with 40 rats in each group.After 3 days modeling and after scalp acupuncture，nerve function，hemoglobin（Hb） and nitric oxide（NO） content in brain tissue fluid，Nrf2，CD36 protein and mRNA expression in cerebral tissue were measured.The distribution of microvessels around cerebral hematoma in each group was observed and the diameter and density index of microvessels were detected.Results：After 3 days modeling，compared with sham group，Hb and NO levels increased，Nrf2，CD36 protein and mRNA expression levels in  cerebral tissue of intervention group  and model group decreased，and microvessel diameter and microvessel density index were decreased（P＜0.05）.After 3 days modeling，neurological function score，microvascular diameter and microvascular density index increased，Nrf2，CD36 protein and mRNA expression levels in the intervention group   decreased  after treatment，and those were better in the model group（P＜0.05）.The levels of Hb and NO in the intervention group were lower than those in the model group（P＜0.05）.After treatment，there were significant differences in microvessel diameter and microvessel density index between the intervention group and the sham group（P＜0.05）.Conclusion：The scalp acupuncture could promote the expression of Nrf2 and CD36 proteins and mRNA in  cerebral tissue of rats with cerebral hemorrhage，decrease the levels of Hb and NO in  cerebral tissue，improve the blood flow state of microvessels around hematoma，and promote the removal of cerebral hematoma.

Keywords cerebral hemorrhage; hematoma clearance; peroxisome proliferator-activated receptor γ/nuclear factor E2 associated factor 2 signaling pathway; scalp acupuncture; rats; experimental study

基金项目 国家自然科学基金面上项目（No.82374570，8194305）；黑龙江省自然科学基金项目（No.LH2023H063）；黑龙江省中医药科研项目（No.ZHY2020-162）；黑龙江中医药大学科研基金项目（No.2019MS24）；黑龙江省首批名老专家学术继承项目（2022—2025年）

作者单位 1.黑龙江中医药大学（哈尔滨  150040）；2.黑龙江中医药大学附属第二医院（哈尔滨  150001）

通讯作者 薛玉满，E-mail：xueyuman@163.com

引用信息 许文婷，孔莹，薛玉满.基于PPARγ/Nrf2信号通路探讨头穴透刺对脑出血大鼠血肿清除的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2024，22（5）：833-838.

脑出血是指非外伤性脑实质内血管破裂引起的出血，是一种严重的急性脑血管疾病，脑出血后形成的脑血肿对周围血管压迫、暂时性缺血及血肿分解毒素，均是引起病人继发性脑损伤的主要原因［1］。目前，虽可经微创手术缓解脑出血后占位效应，临床研究显示，与传统治疗方法比较，微创手术未明显改善病人预后及生存率［2］。脑血肿占位虽被清除，但残存的血肿产物及其降解物持续造成神经血管损害。因此，临床亟须一种可促进红细胞清除及吸收，改善血肿周围微血管，促进脑组织及脑神经功能恢复的有效办法。已知过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、核因子E2相关因子2（Nrf2）在介导内源性脑血肿清除过程中有明显的调节作用，CD36是红细胞及受损细胞吞噬清除的重要介质，通过激动PPARγ/Nrf2信号通路及上调CD36表达，增强小胶质细胞对红细胞的吞噬作用，促进脑血肿的吸收［3］。有研究显示，头穴透刺对脑出血模型大鼠内源性清除脑血肿具有一定的促进作用［4］。本研究基于PPARγ/Nrf2信号通路探讨头穴透刺对脑出血大鼠血肿清除系统的影响，以期为临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠160只（黑龙江中医药大学GLP实验动物中心），体质量（300±20）g，周龄（12±2）周，实验前2周为大鼠适应期，注意饲养温度、湿度等环境控制。

1.2 实验试剂和仪器

1.2.1 实验试剂

苯巴比妥钠（上海上药新亚药业有限公司，国药准字H31020502），Ⅳ型胶原酶［福州奥研实验器材，规格：100 mg（Biosharp）］，水合氯醛（青岛宇龙海藻，国药准字H37022673），羊抗兔IgG（Solarbio，SE134），β-actin（翌圣生物科技，30102ES40），兔抗-CD36（Abcam，EPR22512-58），兔抗-Nrf2（Abcam，EP1808Y），TRIzol试剂盒（R30506），实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative reverse transcription，RT-PCR）试剂盒（赛默飞，18090010）。

1.2.2 实验仪器

脑立体定位仪（江苏赛昂斯生物科技，货号SA301），紫外分光光度计，微量注射器（Hamilton 瑞士，货号1011211402），台式高速冷冻离心机，NanoDrop 2000（Therm公司，美国），超低温冰箱（海信，型号HD-86L390），T100型PCR仪（Bio-Rad，美国），7300型RT-PCR仪（美国ABI公司），显微摄影成像系统（Moticam3000），针灸针（苏州医疗用品，华佗牌），电针治疗仪（上海华谊医用仪器，G6805-Ⅱ型）。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组

将160只大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组及干预组，各40只；模型组及干预组构建脑出血模型，干预组同时进行电针头穴透刺干预。

1.3.2 动物建模

参照相关文献［5］，采用苯巴比妥钠（30  mg/kg）对假手术组、模型组及干预组大鼠进行腹腔注射麻醉，俯卧位固定在立体定向仪上。头中下部切开2.0 cm，在前囟右侧距离颅骨背侧前囟后0.2 mm、中线2.9 mm，点位钻孔（尾状核位置）。空白组不予以任何处理；将微量注射器（针头0.7 mm）沿钻孔进针6 mm，假手术组注射生理盐水1 μL，模型组和干预组均注射（20 min缓慢推进）含有1 U/μL Ⅳ型胶原酶的生理盐水1 μL（浓度66.67%）。待药物完全吸收后，将针头缓慢拔出，使用骨蜡封闭大鼠颅骨孔，缝合手術伤口。以下情况视为大鼠建模不成功（需将各组建模失败数量补齐）：Zausinger评分为5分（无法自发行走为0分；自由行走但向病灶对侧旋转为1分；抓住大鼠尾巴，大鼠向病灶对侧旋转为3分；大鼠病灶对侧前爪无法伸直为4分；无神经功能缺损症状为5分）［6］；示例斩首观察脑组织未出现脑血肿或蛛网膜下腔出血；术后死亡。

1.3.3 分组处理

造模成功后3 d，将假手术组、模型组及干预组大鼠充分固定于操作台上，假手术组及模型组不进行处置，干预组均给予刺“百会”透“太阳”电针治疗。百会：位于大鼠两耳根连线与头中线交汇点；太阳：大鼠外眼角与耳见凹陷位。电针刺激前对相应穴位及器械消毒，取0.25 mm×30 mm毫针，分别刺入百会（向右前太阳穴方向）及右侧太阳穴；将电针仪正极连接百会穴毫针，负极连接太阳穴毫针，调频2 Hz连续波，1 mA电流，留针30 min观察。每日电针干预1次，连续1周。

1.4 观察指标

1.4.1 神经功能评价

造模成功后3 d、头穴透刺治疗周期结束后参照改良马氏评分（Modified Gorcia Score）［7］对各组大鼠神经功能进行评估（计算各项目总分），详见表1。

1.4.2 脑血肿周围微血管图像

参照相关文献［8］，假手术组、模型组及干预组（造模后3 d、干预治疗后）采用照相显微镜（NikonE600，日本）摄取每组10只解剖后大鼠脑组织切片图像，将其导入MIAS2000图像分析系统（四川大学图像研究所）。随机选取每只大鼠紧邻脑血肿部位的10支微血管，测定直径平均值；选取紧邻脑血肿1 mm2视野内的10个紧邻区域（视野面积Sf），测定微血管覆盖面积（Sc），计算微血管密度指数＝Sc/Sf，取平均值。

1.4.3 血红蛋白（Hb）及一氧化氮（NO）检测［9］

参照相关文献［9］，于造模成功后3 d、头穴透刺治疗结束后，每组取10只大鼠，采用5%水合氯醛麻醉后开胸，于右心耳灌入预冷的磷酸缓冲盐溶液（PBS），待心尖部流出清亮液体为止；断头处死大鼠，将脑组织移至玻璃皿中，加入1 100 μL PBS仔细研磨后，将上述混合液以15 000 r/min、4 ℃离心30 min，取上清液。移液管取上清液25 μL移入96孔板中，以1∶4比例逐步加入文齐氏液，室温条件下孵育5 min，紫外分光光度计检测540 nm波长OD值，计算脑组织液Hb水平。采用硝酸还原酶法测量NO，取上清液样本加入8 μL硝酸试剂，孵育30 min后再加入显色剂，静置10 min，紫外分光光度计于550 nm波长、0.5 cm光镜下比色，并计算含量。

1.4.4 免疫组化测定Nrf2、CD36蛋白含量

造模成功3 d、头穴透刺治疗结束后，每组取10只大鼠，用5%水合氯醛麻醉后处死，取血肿周围脑组织制备石蜡标本（10%中性甲醛固定，石蜡包埋），之后制备常规苏木精-伊红（HE）病理切片（4 μm）备用。将上述石蜡切片经脱蜡至水化，封闭通透液（40 mL PBS＋120 μL TritonX-100＋400 μL 30%H2O2）浸润30 min（RT避光），PBS溶液洗脱3次×3 min；依次加入3%H2O2与5%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，温育10 min；滴加一抗，4 ℃冷藏过夜；取出样本PBS溶液洗脱3次×3 min，之后依次滴入二抗、辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG，分别于37 ℃温箱孵育30 min；PBS溶液再洗脱3次×5 min，加入二氨基联苯胺（DAB）显色5～10 min，将显色片用清水洗脱后置于苏木精中10 min，复染后脱水、透明、封片。每张切片取10个200倍镜下视野，由专业病理医师观察判断Nrf2、CD36蛋白表达。

1.4.5 RT-PCR检测Nrf2、CD36 mRNA表达量

造模成功3 d、头穴透刺治疗结束后，每组取10只大鼠，用5%水合氯醛麻醉后处死取脑组织。冰PBS冲洗脑组织后于液氮中保存。取血肿周围脑组织置于玻璃皿中碾碎，加入1 mL TRlzol后移至离心管静置10 min；以12 000 r/min、4 ℃高速离心5 min，取上清液加入氯仿200 μL充分均匀振动，25 ℃静置10 min；再以12 000 r/min、4 ℃离心2次，每次5 min。室温干燥沉淀10 min，加入20 μL蒸馏水溶解。打开NanoDrop2000测定样品中RNA总质量。取上述RNA样本0.5 μg进行逆转录，反应体系：SYBR Green 1染料10 μL＋0.5 μg RNA样本＋2 μmol/L引物（正向、反向引物各1 μmol/L）＋dNTP 1 μL＋TaqDNA多聚酶（50 U/mL）2 μL；在PCR仪上进行PCR周期扩增反应：起始94 ℃ 5 min；30个周期：变性94 ℃ 5 min，退火58 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，最后延伸72 ℃ 5 min，得到PCR产物。记录各样本Ct值，以2－△△Ct计算相对表达量。引物序列见表2。

1.5 统计学处理

采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，符合正态分布的定量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。以P＜0.05为差异统计学意义。

2 结 果

2.1 各组神经功能评分比较

造模后3 d，与假手术组比较，干预组与模型组大鼠神经功能评分均下降（P＜0.05）；与造模后3 d比较，治疗结束后干预组神经功能评分升高，且高于模型组（P＜0.05）。详见表3。

2.2 各组脑血肿周围微血管直径及密度指数比较

与假手术组比较，造模后3 d干预组及模型组微血管直径及微血管密度指数均降低（P＜0.05）；与造模后3 d 比较，治疗结束后干预组微血管直径及微血管密度指数均升高，且高于模型组（P＜0.05），低于假手术组（P＜0.05）。详见表4。

2.3 各組Hb及NO含量比较

与假手术组比较，模型组及干预组造模后3 d脑组织Hb及NO含量均升高（P＜0.05）；与造模后3 d比较，治疗结束后干预组Hb及NO水平降低，且低于模型组（P＜0.05）。详见表5、表6。

2.4 各组Nrf2、CD36蛋白含量比较

与假手术组比较，造模后3 d模型组及干预组Nrf2、CD36蛋白含量均增加；与造模后3 d比较，治疗结束后干预组Nrf2、CD36蛋白含量均降低。详见图1、图2。

2.5 各组Nrf2、CD36 mRNA相对表达量比较

与假手术组比较，造模后3 d模型组及干预组Nrf2、CD36 mRNA相对表达量均上升（P＜0.05）；与造模后3 d比较，治疗结束后干预组Nrf2、CD36 mRNA相对表达量降低，且低于模型组（P＜0.05）。详见表7、表8。

3 讨 论

有研究顯示，脑血肿清除情况是影响脑出血病人预后及生存率的关键因素［10］。脑出血发生数小时后，血块回缩、静水压下降、血浆大量渗出造成血管源性水肿，血块及血小板聚集导致脑血肿周围血管堵塞，脑组织暂时性缺血；随着炎症反应及凝血酶原被激活引发的细胞毒性水肿，血脑屏障被破坏、脑组织代谢活性降低，脑血肿周围微血管及管周星形胶质细胞受损，脑血流量明显降低，脑组织缺血缺氧严重［11-12］；最终红细胞溶解破坏并释放亚铁血红素、NO、铁离子等物质，破坏血脑屏障，引发延迟性脑水肿并加重神经元损伤［13］。本研究结果显示，大鼠造模后3 d模型组、干预组与假手术组比较，脑组织液中Hb及NO水平呈高表达，脑血肿周围微血管直径及微血管密度指数下降，患侧肢体无力、不能自发运动，神经行为功能严重异常。目前脑出血病人早期采用介入治疗，通过清除脑血肿、降压及补体支持，降低脑血肿造成的持续性影响。上述治疗均未有效改善病人预后情况［14］。

相关研究指出，脑出血后脑组织可自发吸收和清除脑血肿内容物，缓解机械性压迫，限制炎症反应并促进神经元恢复［15］。大脑小胶质细胞和血源性巨噬细胞是介导脑血肿清除的第一道防线，CD36是广泛认可的、整合巨噬细胞细胞膜蛋白和Ⅱ型清道夫受体［16］。脑血管破裂后，病灶周围的小胶质细胞和外周巨噬细胞大量富集，一些缺乏吞噬能力的小胶质细胞通过CD36的转染获得吞噬功能［17］。PPARγ是激素受体超家族的一员，参与糖脂代谢、炎症及免疫反应等多种生物学过程，在中枢神经系统疾病中发挥着重要的作用［18］。体外实验表示，PPARγ及其激动剂通过上调CD36表达，增强小胶质细胞介导的红细胞吞噬作用，减轻炎症反应及氧化损伤，减少神经元细胞凋亡，发挥神经保护作用［19］。Nrf2是一种多效性的转录因子，通过核转位干扰血红素诱导血红素加氧酶1蛋白活性，上调CD36等相关蛋白表达，减少红细胞斑块形成，促进巨噬细胞的吞噬作用；调控白细胞介素-10表达升高，抑制氧化应激，减少血红蛋白-血红素-游离铁的积累及自由基的生成，上调CD36表达量，增强脑组织脑血肿的清除功能［20］。本研究结果显示，造模后3 d大鼠脑组织中Nrf2及CD36表达水平上升（与假手术组比较），表明脑血管破裂后机体激发自身脑血肿清除系统，但未进行治疗的模型组在干预组治疗结束后发现，大鼠脑组织中Nrf2及CD36水平及神经功能与造模后3 d比较差异无统计学意义。该结果提示机体自身清除过程缓慢，神经功能可能在长时间脑血肿毒性影响下无法完全恢复。本研究对干预组进行头穴透刺治疗，通过刺“百会”透“太阳”，一针跨越多个穴位和多条经络，通过电流的强烈刺激，改善脑部相应区域的微循环并加快脑血肿吸收。同时本研究结果还显示，与造模后3 d比较，干预组大鼠脑组织液Hb及NO水平均降低，脑组织Nrf2、CD36蛋白及 mRNA均呈高表达，血肿周围微血管直径及微血管密度指数升高。虽然治疗后大鼠神经功能评分仍低于假手术组，脑组织液中Hb及NO水平也略高于假手术组，与模型组比较各指标均表现更佳。

综上所述，头穴透刺可促进脑出血大鼠脑组织Nrf2、CD36蛋白及 mRNA表达，降低脑组织Hb及NO水平，改善血肿周围微血管血流状态，对脑血肿的清除具有促进作用。

参考文献：

［1］ 范敬争，姜玉艳.脑出血后血肿周围水肿形成机制的研究进展［J］.山东医药，2021，61（2）：92-94.

［2］ PANTAZIS G，TSITSOPOULOS P，MIHAS C，et al.Early surgical treatment vs conservative management for spontaneous supratentorial intracerebral hematomas：a prospective randomized study［J］.Surgical Neurology，2006，66（5）：492-501.

［3］ FLORES J J，KLEBE D，ROLLAND W B，et al.PPARγ-induced upregulation of CD36 enhances hematoma resolution and attenuates long-term neurological deficits after germinal matrix hemorrhage in neonatal rats［J］.Neurobiology of Disease，2016，87：124-133.

［4］ 邹伟，刘鹏，于学平，等.头穴透刺法对急性期脑出血大鼠脑组织Beclin1和BNIP3L蛋白表达的影响［J］.中国中医急症，2019，28（6）：950-953.

［5］ 任泽光，吴建中.大鼠脑出血模型［J］.中华神经外科杂志，1993，9（4）：205-207.

［6］ 暴玉振，李凤，李华岚，等.急性脑梗死大鼠脑部MMP-1、MMP-9预测神经功能的价值［J］.中国老年学杂志，2021，41（9）：1940-1943.

［7］ 伊晋莹，王改青，王娟，等.红曲素对大鼠脑出血后脑保护作用机制的探讨［J］.疑难病杂志，2017，16（5）：500-504.

［8］ 吕田明，尹恝，罗一峰，等.大鼠脑出血后血肿周围微血管变化的研究［J］.中国脑血管病杂志，2007，4（10）：454-457.

［9］ 段淑娜.PPARγ-Nrf2通路对于脑出血后血肿清除系统中CD36及SRA的表达调控［D］.太原：山西医科大学，2018.

［10］ 祁波，冯凌云，冒平.微创血肿清除术后IL-6、GFAP、S100A8/A9水平与自发性脑出血患者功能预后的关系及其预测价值［J］.临床与病理杂志，2021，41（11）：2580-2587.

［11］ WAN S，CHENG Y Y，JIN H，et al.Microglia activation and polarization after intracerebral hemorrhage in mice：the role of protease-activated receptor-1［J］.Translational Stroke Research，2016，7（6）：478-487.

［12］ LATTANZI S，DI NAPOLI M，RICCI S，et al.Matrix metalloproteinases in acute intracerebral hemorrhage［J］.Neurotherapeutics，2020，17（2）：484-496.

［13］ WAN J R，REN H L，WANG J.Iron toxicity，lipid peroxidation and ferroptosis after intracerebral haemorrhage［J］.Stroke and Vascular Neurology，2019，4（2）：93-95.

［14］ POON M T，FONVILLE A F，AL-SHAHI SALMAN R.Long-term prognosis after intracerebral haemorrhage：systematic review and meta-analysis［J］.Journal of Neurology，Neurosurgery，and Psychiatry，2014，85（6）：660-667.

［15］ FANG H，CHEN J，LIN S，et al.CD36-mediated hematoma absorption following intracerebral hemorrhage：negative regulation by TLR4 signaling［J］.Journal of Immunology，2014，192（12）：5984-5992.

［16］ WANG G Q，WANG L，SUN X G，et al.Haematoma scavenging in intracerebral haemorrhage：from mechanisms to the clinic［J］.Journal of Cellular and Molecular Medicine，2018，22（2）：768-777.

［17］ CAO D Y，LUO J，CHEN D K，et al.CD36 regulates lipopolysaccharide-induced signaling pathways and mediates the internalization of escherichia coli in cooperation with TLR4 in goat mammary gland epithelial cells［J］.Scientific Reports，2016，6：23132.

［18］ IKEDA Y，SUGAWARA A，TANIYAMA Y，et al.Suppression of rat thromboxane synthase gene transcription by peroxisome proliferator-activated receptor gamma in macrophages via an interaction with NRF2［J］.The Journal of Biological Chemistry，2000，275（42）：33142-33150.

［19］ ZHAO X R，GONZALES N，ARONOWSKI J.Pleiotropic role of PPARγ in intracerebral hemorrhage：an intricate system involving Nrf2，RXR，and NF-κB［J］.CNS Neuroscience & Therapeutics，2015，21（4）：357-366.

［20］ BOYLE J J，JOHNS M，LO J，et al.Heme induces heme oxygenase 1 via Nrf2：role in the homeostatic macrophage response to intraplaque hemorrhage［J］.Arteriosclerosis，Thrombosis，and Vascular Biology，2011，31（11）：2685-2691.

（收稿日期：2022-07-05）

（本文編辑薛妮）