基于“肝主疏泄”调控RPE细胞自噬探讨从虚瘀同治角度论治干性黄斑变性的机制*

张昭,董洋,王莉,梁凤鸣

1.天津中医药大学第一附属医院/国家中医针灸临床研究中心,天津 300193; 2.中国中医科学院广安门医院济南医院,山东 济南 250002

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)是55岁以上人群中心视力丧失的主要原因,常累及患者黄斑结构和功能,其典型病理特征为细胞外沉积物(玻璃膜疣、基底线/板状沉积),可显现新生血管或萎缩。流行病学报告,我国AMD患者总数已超过500万,本病已成为我国防盲治盲和公共卫生工作的重点[1-2]。AMD分为早、中、晚三期,晚期又分为渗出性(湿性)和萎缩性(干性)两类,最终分别演变为盘状瘢痕及地图样萎缩[3]。目前,抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作为湿性AMD的一线治疗药物已得到广泛认可,但对干性AMD病变进展仍无行之有效的干预疗法。研究发现,视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞自噬不足在AMD发病中起到至关重要作用,提出干性AMD自噬靶向治疗研究[4]。中医认为,“肝主疏泄”推动全身气血津液运行,促进瘀积产物排泄的过程与RPE细胞自噬过程一致,是人体维持正常代谢的关键一步。所以,基于“肝主疏泄”理论分析RPE细胞自噬功能或为中医药治疗干性AMD提供新思路和新靶点。

1 “肝主疏泄”是干性AMD发生发展的理论基础

肝主疏泄功能正常对其他脏腑至关重要,如《杂病源流犀烛·肝病源流》所述:“肝和则生气,发育万物,为诸脏之生化。”肝气升发,诸脏之气生升有由,则气血冲和,五脏安定,生机不息。从生理方面分析,“发生之纪,是谓启陈,土疏泄,苍气达,阳和布化,阴气乃随,生气淳化,万物以荣”(《素问·五常政大论》)。从病理方面分析,“人之五脏,惟肝易动难静。其他脏有病,不过自病……惟肝一病,即延及他脏”(《知医必辨》)。笔者认为,肝疏通畅达,宣泄升发才能使气血津液运行通畅,代谢产物而不致瘀积;若肝失疏泄则百病由生。

1.1 “肝主疏泄”释义“疏泄”一词最早见于《素问·五常政大论》,朱丹溪《格致余论》提出:“主闭藏者肾也,司疏泄者肝也。”肝主疏泄的中心环节是调畅气机,具体包括维持气血津液输布、协调脾升胃降、调畅气机、促进胆汁分泌等[5]。肝主疏泄是人一身之气正常运行的重要调控环节,亦是人体一切生命活动的基础。肝失疏泄则导致气血津液运行失常等各种生理机能障碍。从微观看,细胞是最基本的功能单位,人体所有生理机能障碍皆与细胞内的物质能量代谢失常有关。自噬作为细胞内物质循环代谢的重要环节,该功能过度激活或抑制会影响细胞生理功能。因此,“肝主疏泄”与细胞自噬具有很大相似性,肝失疏泄的病机变化势必会在细胞层面得以体现[6]。由此可见,自噬是肝主疏泄在微观层面的具体体现,肝主疏泄又是人体能量代谢平衡的先决条件。

1.2 “肝失疏泄”是干性AMD发生的重要原因中医并无“AMD”这一病名,根据症状体征,将其归为“视瞻昏渺”范畴。视瞻昏渺是因虚致病,本虚标实,虚实错杂的疾患,按病因可分为虚实两类:虚证者多因劳思竭视,耗伤气血,或肝肾亏虚,目失濡养,或阴虚火炎,灼烁津液以致神光暗淡。实证者多为内生痰瘀遮蔽神光致使目昏不明。《素问·金匮真言论》曰:“目受血而能视。”又“肝气通于目,肝和则目能辨五色”(《灵枢·脉度》)。《张氏医通》则云:“气不耗,归精于肾而为精,精不泄,归精藏于肝而化清血。”本病病位在视衣,与肝肾二脏密切相关。玻璃膜疣为干性AMD的特征性表现,RPE细胞老化,自噬功能下降,补体系统被激活,脂褐质、补体膜攻击复合物和炎症物质沉积于RPE细胞基底层,玻璃膜疣形成,AMD病情进一步加重[7]。中医认为,玻璃膜疣为气血虚弱,肝肾亏虚,机体功能衰老的病理产物,属于“瘀结”,治疗时应采用补虚兼化瘀之法[8]。肝主疏泄功能正常,血行通畅目窍才能视物,瘀积清除神光方可发越。由此可见,从“虚瘀同治”论治视瞻昏渺,或可成为中医治疗干性AMD的关键所在。

2 “肝失疏泄”是视网膜色素上皮细胞自噬不足的重要前提

中医藏象学说对眼科临床具有指导意义。众所周知,“五藏”绝非等同于西医实体器官的“五脏”,中医的藏象学说与细胞结构实质上是一种“微观”与“宏观”相结合的学说。随着中医理论与现代医学前沿的细胞生物学相结合,中医与现代医学理论实现真正意义上的融合,如藏象之肝、肾、脾、分别与配体-受体-信号转导系统、染色体、线粒体对应[9-11]。研究发现,“肝”在宏观层面是神经、内分泌系统,在细胞层次即为配体-受体-信号转导系统[12]。神经末梢释放的递质和内分泌细胞分泌的激素,从根本上说都属于细胞信号,它作用于靶细胞受体,激活细胞内的第二信号系统,进而产生细胞内一系列特异性生理应激改变,集体应激改变则形成宏观的生理进程。肝体阴而用阳,司疏泄,具有启迪诸脏,调畅气机的作用。这与在细胞间传递信息的神经递质、激素作用特点相似,起着激发和调节靶细胞生理功能的作用。可见,无论从细胞生物学还是中医理论分析,视网膜作为神经系统一部分自然受“肝主疏泄”调控。

庞赞襄老先生认为:“人之脏腑……五官九窍皆非实体,而内涵脉道孔窍,气血循环往来其中。”“目乃九窍之一,皆赖气血以滋养,然气血以和畅为顺,少有怫郁,则目病丛生。”正常情况下,气机运行,气载津血,津血因气而运,三者相互维系,循环不已。肝经的玄府畅通,肝气即可上升,目中即有主宰,五脏之精,各展其用,终能分辨五色。若肝失疏泄,厥阴经络玄府瘀闭,一方面,导致机体生成的营养物质无以充养目窍,视衣功能活动减退;另一方面,网膜水液输布异常使得痰浊、血瘀等病理产物沉积而形成玻璃膜疣。痰浊血瘀等病理产物的存在,进一步阻碍气血津液的正常运行,继续加重细胞自噬不足状态,形成疾病虚实夹杂的恶性循环。

3 自噬不足是干性AMD发生发展的重要标志

自噬指溶酶体对细胞内大分子物质以及受损细胞器进行降解、重新利用的过程。自噬分小自噬、大自噬和分子伴侣介导的自噬,其中大自噬是RPE细胞自噬的主流。自噬通过清除细胞质内已经受损的细胞器以及代谢产物,重构亚细胞水平,使细胞处于健康状态,并对受损的细胞进行保护[13]。RPE细胞有典型的自噬能力,起到“清道夫”作用,其自噬活性降低可以导致视网膜异常蛋白及脂褐素的积累,引发活性氧产生和蛋白质聚集。这些物质不仅导致脂褐素形成,同时激活炎症反应,加速细胞衰老,进一步加快AMD进程[14]。自噬与干性AMD的关系具体归纳如下。

3.1 自噬、免疫炎症反应与干性AMD研究表明,诸如炎症小体生成,补体途径等免疫炎症反应参与了干性AMD的病理进程[15]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor containing pyrin domain 3,NLRP3)是由凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD domain,ASC)以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific protease-1,Caspase-1)共同组成的多蛋白复合物。生理条件下,当RPE细胞受危险信号刺激时,NLRP3可通过ASC招募Caspase-1,并使其成熟,最后诱导白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-18分泌,促进炎症的发生,造成细胞凋亡。玻璃膜疣本质上是细胞外的颗粒蛋白质聚集体,亦是NLRP3介导的无菌炎症反应的激活剂。自噬作为一种免疫机制能调节免疫炎症首先体现在去除NLRP3激活因子,减轻炎症小体激活和炎性反应[16]。自噬也可以通过保护线粒体完整性,减少线粒体DNA向胞浆释放,进而抑制NLRP3激活[17]。

3.2 自噬、氧化应激与干性AMD自噬可以通过调控脂褐素沉积等病理改变减轻RPE细胞损伤,进而延缓疾病进程。正常生理条件下,RPE细胞需要大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)满足代谢及信号通路需求,抗氧化酶如过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等维持细胞内ROS的生成与清除平衡。而黄斑区汇集网膜最高血流量,这使该区RPE细胞始终处于高危环境中,一旦氧化应激失衡,ROS产生过多或抗氧化酶活性下降即会造成RPE细胞损伤,进而产生相应病理改变。Baek等[18]研究发现,自噬和氧化应激相互影响与暴露时间相关,如短期暴露在低剂量氧化应激条件下,RPE自噬水平显著提升以清除氧化损伤的细胞器;相反,慢性氧化应激会使自噬水平下降,稳态无法维持,同时自噬的下调使RPE细胞更易受氧化应激影响而凋亡,进而导致AMD发生。此外,氧化应激能产生脂褐素,其主要成分为N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(N-retinyliden-N-retinylethanolamine,A2E)。张晶晶等[19]发现,A2E会刺激人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19细胞)分泌多种AMD相关炎症因子和新生血管因子,诱导ARPE-19细胞的自噬。可见,在氧化应激的过程中,自噬能通过抑制ROS的产生延缓本病发生。

雷帕霉素靶向蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路是RPE细胞自噬调控的重要信号通路。生理条件下,活化的mTORC1抑制自噬的发生,当细胞受到营养不足、缺氧、氧化应激等不利因素刺激下,mTORC1就会启动自噬发生。PI3K/ AKT信号是自噬负调控因子,位于mTOR分子的上游,当自噬启动后,早期自噬小体膜形成。而自噬体膜封存依赖于微管相关蛋白1轻链3 (LC3),LC3-Ⅱ 则为自噬活性的重要标志分子[20]。LC3-Ⅱ特异性招募p62参与对自噬底物的选择,泛素结合蛋白p62有一个特殊的区域命名为LC3识别序列。p62作为自噬特异性下游底物被自噬-溶酶体通路降解,降解过程通过与LC3相互作用实现[21]。p62又通过信号传导选择自噬受体,对自噬效应调控。本课题组正以RPE细胞自噬为切入点,对RPE细胞活力、信号通路蛋白mTOR、自噬标志性蛋白LC3、上游因子PI3K/Akt、下游底物p62等相关因子表达进行对照研究,观察对RPE细胞自噬功能的靶向保护作用,以期探明杞黄颗粒治疗干性AMD的理论依据。

4 中医药调节自噬功能治疗干性AMD

《证治准绳》认为:“若年过五十意外而昏者……天真日衰,自然目光渐谢。”此处天真即为肾之精气。而肝肾同处下焦,肾藏精,肝藏血,血从精化,是谓“乙癸同源”。若肝肾之精日渐衰微,视衣失其所养,则视瞻功能减退。西医认为,RPE细胞代谢和衰老与AMD密切相关,而RPE生理功能正常依赖视网膜血供维持营养所需。“内五轮学说”认为,RPE属于肾[22],同时“肝主藏血,肝受血而能视”,故治疗本病应注意“补虚化瘀”。笔者认为,肝体阴而用阳主动,肾主阴水而主静,肝阴肾水即为一体,而“肝主疏泄”,气血上注于目,因而明目必先养血柔肝。而肝疏泄条达依赖于肾水的滋养[23],木得水养,则疏泄有度,气机畅达,目中玄府通利,气血津液上承目窍,神光方可发越无阻,实现“肝气和则目能辨五色”。

杞黄颗粒是梁凤鸣教授治疗AMD的经验复方,主要成分为枸杞子、楮实子、茺蔚子、丹参等,具有补益肝肾、化瘀祛痰之功。本课题组分别于2000年制成口服液“枸杞明目液”,2005年制备成“枸杞明目方”免煎剂院内协定处方,之后进一步改变剂型为杞黄颗粒,处方药物组成保持不变;并从临床疗效、视网膜光损伤病理、CFH基因多态性及VEGF上下游调控因子等多方面进行研究[24-28],显示该药对于干性AMD治疗效果明显优于湿性AMD。全方配伍精当,标本兼治,切中视瞻昏渺虚实夹杂之特点,或可成为治疗本病发生发展、提高患者视力水平的选择。

5 结语

干性AMD发病率高,因其表现为中心视力进行性损害,不易引起人们重视。若病情进展至晚期会对患者的视力健康和生活质量构成严重威胁。目前,临床并无公认的治疗干性AMD的药物,临床普遍推荐使用抗氧化维生素和矿物质等,但疗效欠佳。RPE细胞自噬不足与AMD发病关系密切,自噬机制及其靶向干预成为治疗干性AMD研究的前沿热点。基于需求导向及中医药治疗干性AMD的临床优势,笔者总结几代师承经验,应用杞黄颗粒方(驻景丸加减方化裁)积累了比较扎实的临床基础和良好的研究基础。在未来,课题组结合“肝主疏泄”的中医理论基础,切中本病“虚中夹瘀”之病机,拟通过蓝光诱导大鼠视网膜损伤及RPE细胞自噬功能损伤,观察中药复方对RPE细胞mTOR自噬通路的干预机制,进一步阐明杞黄颗粒治疗干性AMD的科学理论,以期更好地服务于临床。