骨质疏松骨重塑分子机制的研究进展

戴厚杰 王洪凯

(桂林医学院第二附属医院骨一科,广西 桂林 541199)

骨质疏松(OP)是一种由骨吸收和骨形成之间的失衡,导致骨骼破坏超过了骨骼形成造成的全身性骨骼疾病,其特征是由于骨微结构破坏导致骨强度下降,增加了骨的易脆性〔1,2〕。它是一种高度流行的疾病,估计影响全球2亿人口,主要发病年龄在60岁以上〔3〕。2018年,我国OP流行病调查结果显示,50岁以上人群患病率为19.2%,而65岁以上人群患病率达32%。由OP引起压缩性骨折,每年就高达890多万例之多,预计到2050年,这个数字将增加两倍〔4〕。由于治疗费用、高发病率和死亡率及劳动人口生产力的丧失,日益增加的OP给发达国家和发展中国家的卫生保健系统带来了沉重的社会和经济负担〔5〕。因此OP应该运用合理的方法进行有效预防治疗,迄今为止,在OP的治疗上,抑制骨吸收的双磷酸盐(BPs)是治疗最常用的药物之一。然而,由于目前使用的药物的副作用和有限的疗效,人们一直试图寻找其他新的药物。而这就需要对OP骨重塑分子机制进行深入研究。本文就OP骨重塑的分子机制研究进展进行综述。

1 骨重塑的分期

OP的形成是由于骨吸收超过骨形成,导致骨在重塑过程中的失衡所致。骨重塑对骨稳态至关重要,涉及骨形成和骨吸收的平衡协调〔6〕。一般情况下,骨重塑可分为5个阶段:(1)激活期,即骨重塑由局部机械信号或激素信号启动;骨细胞被认为能够感知这些信号并将其转化为骨骼中的生物反应〔7〕。(2)再吸收阶段,成熟的破骨细胞分泌基质金属蛋白酶(MMPs)消化矿物质和有机基质。在这个阶段,Howship的吸收陷窝在冠层细胞下形成〔8〕。(3)逆转阶段,成熟的破骨细胞发生凋亡,成骨细胞被定向到骨吸收位点。转化生化因子(TGF)-β等局部分子会被释放,诱导成骨细胞开始骨形成〔9〕。(4)成骨阶段,成骨细胞主导骨重塑过程,此过程通常需要4～6个月〔10〕。许多局部和全身的调节因子如Wnt、骨硬化蛋白和甲状旁腺激素(PTH)会诱导骨的成骨细胞发生。由不同蛋白质(如Ⅰ型胶原)组成的有机骨基质(类骨)开始沉积,直到实现骨吸收的全部补偿。(5)终止期,即等量的骨基质被再吸收和形成,形成期将终止。成骨细胞要么发生凋亡,要么形成新的骨细胞〔11〕。骨矿化开始并完成均在此阶段〔12〕。

破骨细胞、成骨细胞和骨细胞是直接参与骨重塑的三种重要的骨细胞〔13〕。同时骨的形成,是由间充质干细胞(MSC)来源的成骨细胞和组织特异性巨噬细胞多核来源的破骨细胞骨吸收协调,以维持骨矿物稳态和强度。骨质流失可能是由于每种细胞类型的功能失常而引起的。

2 破骨细胞

破骨细胞是促进骨重塑的主要吸收细胞,其缺陷可导致骨重塑的不平衡〔14〕。它是一种多核细胞,黏附在骨头上并吸收骨头,导致形成孔洞并将钙释放到血液中。这些细胞是在单核/巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子受体激活因子(RANK)及其配体(RANKL)的刺激下,从造血干细胞(HSCs)分化而来的〔15〕。其他因素中,包括炎症细胞因子,如白细胞介素(IL)-1、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α和αVβ3整合素,也可以调节破骨细胞的分化和功能〔16,17〕。一旦RANK受体与其配体发生相互作用,TNF受体相关因子(TRAF)6等分子被招募,导致丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联、核因子(NF)-κB、蛋白激酶B(AKT/PKB)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和细胞外调节蛋白激酶(ERK)下游信号通路的激活及参与破骨形成的基因表达。

M-CSF/c-fms系统和RANKL/RANK/骨保护素(OPG)系统这两种信号系统在破骨细胞的调控中起着关键作用。M-CSF也是破骨细胞存活的重要因素。M-CSF受体c-fms就是其中之一,其表达是破骨细胞前体形成的标志〔8〕。M-CSF与c-fms结合后,转录因子c-FOS上调,导致RANKL的受体RANK的表达,并伴有PU.1、眼小畸形关联转录因子(MITF)等多种转录因子〔18〕。M-CSF途径还可激活B细胞淋巴瘤(Bcl)-2,Bcl-2是细胞凋亡预防的重要因子。RANKL/RANK/OPG系统是破骨细胞活性的主要决定因素。RANKL是一种同型三聚体跨膜蛋白,属于TNF超家族。它存在于多种细胞类型的表面,包括成骨细胞和骨细胞,并可被MMP劈裂产生可溶性形式。而这种可溶形式保留了激活RANK的能力〔19〕。有研究表明,OPG是一种可溶性分泌蛋白,是RANKL的可溶性诱饵受体,通过竞争性地与RANKL三聚体结合,阻止RANKL诱导的破骨细胞成熟,促进破骨细胞凋亡〔20,21〕。

PI3K-AKT通路在破骨细胞分化和活化过程中发挥关键作用〔22〕。Rho GTPase家族成员RhoA被报道能抑制AKT活性,负性控制破骨形成〔23〕,由鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基(G)α13介导,在细胞骨架组织过程中位于RhoA上游。Gα13的缺失有利于破骨细胞的形成,增大破骨细胞的大小。与此相一致的是,组成性活性Gα13(Ga13CA)抑制了多核破骨细胞的形成。事实上,Ga13CA过表达的单核细胞为trap阳性,说明Ga13CA调控的是破骨细胞成熟的后期而不是早期,能够靶向骨丢失而不影响正常骨重塑〔23〕。相关研究者认为Gα13和RhoA主要通过下调破骨细胞形成和骨吸收介导,在OP中起重要作用〔24〕。

破骨细胞通过分泌蛋白水解酶和盐酸诱导骨吸收,这是一个矿物溶解和骨降解的过程〔25〕。破骨细胞释放的重要蛋白水解酶是溶酶体酶(如组织蛋白酶K)和MMP-9〔26〕。这可能是对PTH和降钙素刺激的反应。甲状细胞激活的破骨细胞可以释放矿物质回到血液中,这是钙稳态机制的一部分〔13〕。PTH也可间接增加成骨细胞的增殖。

3 成骨细胞

成骨细胞诱导的新骨的发育大约在受精后6 w开始于胚胎。骨形成可分为两种类型:膜内骨化和软骨内骨化。在膜内骨形成过程中,MSC增殖并分化为成骨细胞,成骨细胞通过合成细胞外基质蛋白产生骨,如最丰富的Ⅰ型胶原。一旦开始沉积,细胞外基质随后就会通过磷酸钙以羟基磷灰石〔Ca10(PO4)6(OH)2〕的形式积累而矿化〔27〕。

MSC被认为是成骨细胞的祖细胞,具有分化成其他几种细胞类型的能力,如脂肪细胞和软骨细胞。信号分子,比如Runt相关转录因子(Runx)2、Osterix(Osx)、β-catenin、激活转录因子(Atf)4和激活蛋白(AP)-1家族,这些都在成骨细胞转换中起关键作用,任何一种转录因子的缺少都会导致体内成骨细胞的不完全〔28〕。Runx2是一种上游转录因子,参与调节成骨细胞分化的关键转录因子。在成骨细胞中,Runx2调控Sp7蛋白表达,而Sp7蛋白也是成骨细胞分化和骨基质基因的关键转录因子〔29〕。Runx2及其共激活因子Cbtβ将引导MSC分化为前成骨细胞。而Runx2的下游调控因子Osterix则会与Runx2合作,进一步引导前成骨细胞向未成熟成骨细胞分化〔30〕。β-连环蛋白也是一种Runx2的下游因子,通过参与Wnt通路能够增强Runx2的表达〔31〕。Runx2表达式的时间似乎很重要。Runx2在未成熟成骨细胞中表达达到峰值,在成熟成骨细胞中表达下降,Ⅱ型Runx2过表达由于抑制成骨细胞的成熟而导致严重的骨质减少〔32〕。此外,根据细胞类型的不同,Runx2可以增强或降低骨钙素的表达,而骨钙素是成熟成骨细胞的表型标志物〔33〕。Runx2也可能抑制成骨细胞向骨细胞的分化,说明Runx2在成骨细胞分化中具有双重作用〔34〕。

在几种调节MSC分化途径中,Wnt通路是最重要、最完善的调控成骨细胞形成的通路〔35〕。Wnt家族包含19种分泌糖蛋白,它们在骨骼发育、维持骨骼稳态和骨骼重塑中都是不可或缺的〔36〕。在典型的Wnt通路中,β-catenin与axin和结肠腺瘤息肉易感蛋白(APC)形成复合物,在没有Wnt配体的情况下进行磷酸化和降解〔37〕。当Wnt配体与特定的Frizzled受体(FZD)和辅受体LRP5/6结合时,它们将从复合物中释放β-catenin并阻止其降解。这样,β-catenin就会在细胞内积累并转运到细胞核,调控其靶基因,包括编码Runx2、osterix和OPG的基因,这些基因的表达会增加〔38〕。研究还发现Wnt通路可抑制MSC向脂肪细胞分化的调节因子PPAR-γ的活性,进而抑制脂肪形成,促进MSC向成骨细胞的分化〔39〕。Wnt信号通路已被证实可增加骨量和骨强度,特别是,对硬化代表的抑制已被证实具有非常有效的骨合成作用,可增加骨形成和骨密度〔40〕。

在骨形态发生蛋白(BMPs)和Wnt(主要是Wnt3a和Wnt10b)的刺激下Runx2的水平增加,而这个过程是通过激活卷曲蛋白和脂蛋白受体相关蛋白(LRP)-5/6受体介导的〔41〕,最终导致成骨细胞的形成,促进骨的形成。同样,TGF-β1、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子(IGF)-1、Notch和PTH也被证明可以促进骨形成〔42〕。在骨骼重塑过程中,TGF-β1从骨基质中释放,聚集MSCs,从而进一步生成成骨细胞〔43〕。

成骨细胞除了通过合成细胞外基质来形成骨骼外,还通过正负反馈调节破骨细胞来调节骨量。RANKL是一种同型三聚体跨膜蛋白,通过骨细胞、巨噬细胞、成骨细胞、骨髓干细胞和活化的T淋巴细胞表达〔44,45〕。成骨细胞表面RANKL表达的突出作用是通过细胞间依赖的接触激活促进破骨细胞的分化。RANKL还对破骨细胞凋亡起到一定的抑制作用。同时人类RANKL基因和RANKL基因敲除小鼠的基因突变与破骨细胞缺乏和严重骨硬化相关,表明成骨细胞在骨重塑中发挥关键作用〔46〕。

4 骨细胞

骨细胞是成熟的成骨细胞,具有更分化的形态,是骨组织中主要的细胞成分之一,完全嵌入在骨基质中,占全部骨细胞的90%以上。骨细胞与相邻的骨细胞、成骨细胞和内皮细胞保持联系,并通过间隙连接进行交流〔47〕。骨细胞是骨中重要的力学感应细胞,能将机械力转化为细胞信号以维持骨稳态,还能产生各种蛋白和信号分子,如硬化蛋白、组织蛋白酶K、Dickkopf相关蛋白(DKK)1等,以调节成骨细胞及破骨细胞活性〔48〕。它通过释放激素和感知骨的机械负荷,作为骨重塑的主要调节因子〔49〕。骨细胞来源于MSC来源的成骨细胞,这些成骨细胞可以通过分泌Wnt信号通路的刺激因子,如一氧化氮和ATP及硬化蛋白和DKK1等抑制剂来调控骨形成。硬化蛋白和DKK1通过抑制Wnt/β-catenin信号通路和降低Runx2表达,从而影响降低成骨细胞的功能〔50〕。小鼠遗传学研究表明,骨中有条件的缺失DKK1和(或)Sost可以显著增加骨量〔51〕。感知和转导骨骼机械力的分子靶点可能包括多胱氨酸和TAZ复合物〔52〕、整联蛋白〔53〕和半通道〔54〕。骨细胞可以分别通过表达RANKL和M-CSF,或一氧化氮和OPG来调节破骨细胞的激活或抑制〔55〕。

5 脂肪细胞

在与衰老相关的骨质流失及糖尿病等疾病中,骨髓脂肪的生成起着非常关键的作用。来源于骨髓的脂肪细胞分化与成骨细胞分化具有同源性,而成熟的脂肪细胞表达RANKL并促进破骨细胞的形成〔56〕。值得注意的是,在脂肪转录因子中,过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ被认为是造血干细胞向破骨细胞分化的主要因素〔57〕。PPARγ下调MSC和HSC中Wnt/β-catenin信号通路,分别抑制成骨细胞生成和激活破骨细胞功能。在破骨细胞中PPARγ介导过氧化物酶体增殖物,激活受体-γ辅激活因子-1β的表达(PGC1β),从而促进线粒体生物发生,进而增加骨吸收〔58〕。

除了骨细胞和脂肪细胞中的转录因子的调控外,脂肪因子如趋化素、抵抗素、内脏脂肪素、瘦素、脂联素和网膜蛋白-1也会产生旁分泌作用脂肪细胞已经被证明参与了骨骼重塑。有趣的是,趋化素的同源受体,趋化因子样受体(CMKLR)1在MSCs中被发现,趋化素/CMKLR1信号可抑制Wnt/β-连环蛋白和Notch信号通路,从而抑制成骨细胞的形成〔59〕。趋化素/CMKLR1信号诱导NFATc1在造血干细胞中的表达,这是破骨细胞分化的关键转录因子,表明趋化素可能在疾病状态下增强骨丢失〔56〕。其他脂肪因子,如内脂素和抵抗素表现出类似的活性,尽管内脂素在骨重塑中的作用还存在争议。在正常情况下,骨形成是由包括RANK-RANKL在内的细胞-细胞接触调节的,然而,脂肪细胞和脂肪因子在骨质丢失相关疾病中发挥关键作用。

综上,OP骨重塑是通过骨细胞、破骨细胞及成骨细胞等共同作用下发生的。在各种细胞的增生及分化过程中,细胞信号通路起到非常关键作用,它们通过对细胞分子通路上某些靶向信号蛋白的调控,实现其影响作用。最近几十年里,骨代谢生物学及分子生物学机制已取得重大进展,对骨重塑与破骨细胞分化的过程已经有比较清楚研究,然而,对成骨细胞的生物学特性的认识,骨细胞之间的通信和其他细胞的参与,特别是免疫细胞,仍有较多问题不是很清楚。总体而言,对OP骨重塑的分子机制研究还需更进一步深入研究,期待发现新的信号通路,同时也为OP的治疗提高新的药物靶点。