血小板、中性粒细胞在炎症反应与血栓形成中的作用

李明花 遇红梅

(吉林大学 1第一医院,吉林 长春 130061;2中日联谊医院)

中性粒细胞和血小板均调控天然免疫所参与的炎症反应和血栓的形成。血小板对于形成止血栓以防止出血至关重要,而中性粒细胞是抵抗入侵病原体的免疫防御的守护者。血小板和中性粒细胞是外周血中丰富的细胞。从传统意义上讲,血小板发挥着重要的止血作用,而中性粒细胞对先天免疫反应很重要。血小板和先天免疫之间的相互作用及随后凝血激活的触发,是宿主系统的一部分,以防止病原体在血流中系统传播。可通过调节血小板、中性粒细胞外诱捕网(NETs)、细胞因子来介导炎症反应和血栓形成。当细胞因子产生过度时,血管通透性增加及炎症使血液处于高凝状态,容易导致血栓形成。血栓与炎症相互作用可通过NETs、血小板、细胞因子相互作用调节。本文将对血小板和中性粒细胞相互作用及其串扰与血栓形成的关系进行阐述。

1 炎症与天然免疫

1.1炎症反应 炎症反应是常见的病理过程,并且是重要的一种免疫防御机制〔1〕。炎症是损伤和抗损伤的统一过程,正常的炎症反应对人体有利,是人体免疫力的一种表现。局部血液循环在发生急性炎症时会发生一系列变化,造成细动脉在炎症介质作用下短暂收缩,持续数秒至数分钟;毛细血管在细动脉短暂痉挛后会出现扩张,导致血流加快,形成炎症性充血;当血液通透性增高,血液黏稠度增加,则会导致血液成分渗出,启动机体天然免疫应答。

1.2天然免疫 天然免疫是机体防御病原体的第一道防线。天然免疫通过模式识别受体(PRPs)感受并识别各种内外刺激信息〔2〕。与此同时,PRPs能够识别损伤相关分子模式(DAMPs)和病原相关分子模式(PAMPs),引起一系列免疫应答反应,对入侵病原体作出快速反应,清除各种损害因子,达到修复机体损伤的目的〔3〕。

Toll样受体(TLRs)家族成员包含13种,在天然免疫中发挥重要作用。不同TLRs可识别不同的病原刺激分子,其中识别细菌和真菌成分主要为TLR1～5,识别病毒、内生物刺激分子及微生物核酸主要为TLR3和TLR7～13〔4〕。当TLRs识别PAMPs/DAMPs后,通过激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核转录因子(NF)-κB等信号通路,启动核转录功能,诱导促炎细胞因子分泌,发生炎症〔5〕。革兰阴性菌细胞壁主要成分脂多糖与单核/巨噬细胞表面TLR4结合,通过修饰MAPK磷酸化、NF-κB水平,上调细胞因子表达,而抑制MAPK磷酸化、NF-κB水平可抑制细胞因子释放〔6〕。

1.3炎症相关细胞因子 细胞因子在细胞信号转导中起关键作用,并且可通过受体作用调节机体免疫应答,在介导创伤、炎症反应中具有重要作用。细胞因子包括促炎和抗炎细胞因子。适当分泌的细胞因子经旁分泌作用,激活中性粒细胞/巨噬细胞,发挥抗炎作用,杀灭病原体〔7〕。大量释放细胞因子会激活内皮细胞,提高血管通透性,免疫细胞渗出到炎症部位对病原菌进行吞噬并杀灭。抗炎细胞因子转化生长因子(TGF)-β、白细胞介素(IL)-13、IL-10和IL-4等与促炎细胞因子如干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6、IL-2和IL-1等之间失衡是引起炎症的关键性因素。细胞因子过多导致细胞因子风暴,是导致炎症损伤的重要原因。细胞因子过度表达是某些疾病形成重要因素,比如血栓。

2 血栓和血小板

2.1血栓 血栓是指在活体的血管和心脏内,循环血液中有形成分在血管内形成栓子,造成血管部分或完全堵塞,相应部位血供障碍的病理过程。可由血小板与细胞因子相互作用导致,动脉血栓富含血小板,形成于破裂的动脉粥样硬化斑块的侧面或周围,常发生在高切变流处,可发挥止血与宿主防御功能,血小板与细胞因子作用由NETs介导。而静脉血栓富含纤维蛋白和红细胞,常发生在慢切变流处。

按照血管结构或者血管损伤,两种主要机制介导血管内稳态及血栓形成〔8〕。其中一个主要是由组织因子(TF)依赖的,而另外一个主要是由胶原介导的。TF是外源性凝血级联反应的主要启动因子。内皮细胞在正常止血过程中可能会受到损伤,从而导致内皮下间隙的胶原暴露。在血小板激活因子(PAF)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的刺激下,TF移位到细胞表面,触发凝血酶生成和血栓形成〔9,10〕。活化血小板通过分泌聚集性介质产生凝血酶而对其他循环血小板进行招募。TF可介导前凝血酶向凝血酶转化、凝血级联反应的激活及纤维蛋白生成。血栓形成有多种机制,其中一种是血小板异常与细胞因子相互作用导致血栓形成〔11〕。

2.2血小板 血小板是小的无核细胞碎片,来源于巨核细胞,血小板在宿主防御中发挥作用,在止血和凝血过程中具有形成血栓、堵塞创口、释放与凝血有关的各种因子等功能。血小板在宿主防御中发挥作用,包括产生多种炎症介质,如生长因子、细胞因子和趋化因子,调节免疫细胞,甚至有吞噬细菌和病毒的能力〔12～14〕。血管受损时,血管平滑肌通过交感神经的轴突反射,血管收缩,血流缓慢,使血小板在受损局部黏附、聚集。血小板除原发性止血的作用外,还参与先天免疫和识别病原体相关的分子模式,如TLRs的识别。研究发现,人血小板表达TLR1、2、4、6、8和9。而其中的TLR2/1二聚体主要用于二酰化脂蛋白识别,其中的TLR4主要用于结合革兰阴性菌的脂多糖。如TLR2激活剂三酰脂肽(PAM3-CSK4)可诱导血小板聚集〔15〕;TLR4激活剂脂多糖能够增强血小板的聚集引起纤维蛋白原与血小板结合能力增强〔16〕。

研究表明,活化的血小板会通过脱落的形式导致其他病理生理状态,包括动脉和静脉血栓的形成。如动脉血栓,在血管损伤部位高剪切条件下,通过血小板糖蛋白(GP)Ⅰb-血管性血友病因子(vWF)-血小板膜糖蛋白Ⅵ与胶原相互作用,而黏附于暴露的细胞外基质上,导致血小板整合素GPⅡbⅢa活化,扩散,聚集成血栓并释放包括反馈激动剂二磷酸腺苷(ADP)在内的颗粒物,形成血栓素(TX)A2,促进循环血小板募集至局部血栓。血小板包含3种主要的颗粒类型——致密颗粒、α颗粒和溶酶体。α颗粒是血小板特有的,是血小板中蛋白质储存的主要部位。致密颗粒(又称δ颗粒)即小分子储存的部位。血小板颗粒是炎症介质包括TNF-α、TGF-β、趋化因子的重要来源。血小板颗粒主要含有蛋白质〔包括趋化因子配体5(RANTES)〕、膜相关受体(例如,αⅡbβ3和P-选择素)和可溶性物质〔例如,血小板因子(PF)4和纤维蛋白原〕,此外还包括中性粒细胞激活肽(NAP)-2、内皮细胞调节剂(例如鞘氨醇-1-磷酸)、血清素和生长因子、血小板衍生生长因子(PDGF)和血管内皮生长因子(VEGF)等〔17〕。在血栓形成、炎症的发生过程中涉及P-选择素和CD40-配体(CD40-L)在内的其他蛋白质向血小板表面的转移〔18〕。血小板通过其膜上的TLR对病原体相关分子模式进行检测,释放杀菌产物并诱导中性粒细胞脱颗粒和中性粒细胞外陷阱形成〔19〕。

3 中性粒细胞

3.1中性粒细胞简介 中性粒细胞占人类白细胞总量的40%～70%〔20〕。中性粒细胞是专职吞噬细胞,具有很强趋化作用和吞噬功能,是先天免疫系统的重要组成部分。当机体出现损伤时,局部的炎性介质使内皮细胞激活,黏附于血管内皮。黏附的中性粒细胞在趋化因子的作用下能够发生骨架蛋白重构,并且向损伤组织或者感染病灶迁移,以此能够发挥杀菌作用和吞噬作用〔21〕。

中性粒细胞的稳态由抗凋亡与促凋亡信号的平衡维持的,对及时终止炎症反应尤为关键〔22〕。凋亡延迟的中性粒细胞无法及时被巨噬细胞清除,持续释放细胞因子,导致细胞因子风暴,打破机体促炎与抑炎的平衡从而进一步加剧组织损伤。

3.2NETs NETs是由中性粒细胞释放到胞外的含有DNA、组蛋白及组织蛋白酶G的纤维网状结构,可通过捕获病原体来发挥杀菌作用。NETs以解聚的染色质作为骨架,上面镶嵌着核组蛋白、多种颗粒蛋白和某些胞质蛋白,形成了局部高浓度的杀菌分子环境〔23〕,杀灭寄生虫、真菌、伯氏包柔螺旋体、革兰阴性菌及革兰阳性菌,甚至能够捕获人类免疫缺陷病毒(HIV),并通过髄过氧化物酶和α-防御素清除HIV。NETs可绑定红细胞和血小板,并可诱捕病原体。染色质解聚是NETs形成过程中重要特征,参与NETs形成的为肽基精氨酸脱亚氨酶(PAD)4。PAD4在组蛋白H3中将精氨酸转化为瓜氨酸,导致核膜破裂并在形成及肿瘤生长和转移中起重要作用。

3.3影响NETs形成的因素 除致病微生物外,脂多糖、活化的血小板和内皮细胞IL-8、干扰素、佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)均可刺激中性粒细胞产生NETs。NETs促进血栓形成作用主要通过凝血因子、血小板、内皮细胞相互作用。与此同时,血管中NETs的形成可使血小板黏附、聚集和激活,并且NETs可招募红细胞,诱导血栓形成,用DNA处理NETs后由于降解了其网状结构,因此能够阻止血栓形成。

4 中性粒细胞、炎症与血小板相互作用影响血栓的形成

4.1NETs与血小板及细胞因子相互作用 NETs可与血小板表面TLR结合。研究报道表明,高迁移率组蛋白1可激活血小板,从而能够诱导中性粒细胞形成NETs〔23〕。同时,活化的血小板能够提供促进NETs形成的信号,并且能够对其自身活化状态进行维持。释放的NETs会促进血栓前状态并进一步活化血小板〔24〕。活化后的血小板可以通过P-选择素与中性粒细胞表面受体P-选择素糖蛋白配体(PSGL)-1结合而黏附在中性粒细胞上并刺激嗜中性白细胞释放NETs;当脂多糖(LPS)浓度达到足够水平时,可诱导NETs形成及中性粒细胞活化〔25〕。Kambas等〔26〕通过免疫印迹和激光共聚焦显微镜评估NETs中组织因子的表达情况,采用流式细胞仪对中性粒细胞来源的微颗粒表面组织因子进行检测,发现中性粒细胞来源的组织因子在NETs诱导的血栓形成过程发挥重要作用。外源性凝血途径从释放组织因子开始,NETs的弹性蛋白酶可以使组织因子途径抑制剂水解而失活,促进外源性凝血过程,导致血栓形成;NETs能够直接激活内源性凝血途径的组织因子及凝血因子Ⅻ,从而能够启动凝血级联〔27〕。NETs中存在的特异组蛋白H3和H4,能够结合vWF诱捕血小板及通过DAMPs激活补体途径,从而诱导其聚集形成血栓〔28〕。急性心肌梗死患者的血栓中含有大量中性粒细胞和高水平的NETs,由此可见在动脉血栓形成中NET具有重要作用〔29〕。

4.2血栓炎症 炎症与血栓形成之间存在网络关系,其中一方面是血栓形成的产物可引起炎症;而另一方面炎症能够促进高凝状态。在血栓形成中,炎性细胞的作用可能是通过中性粒细胞及白细胞分泌的多种炎性介质及细胞因子作用于内、外源性凝血系统的一些环节,从而引起血栓形成〔30〕。血小板在炎症部位维持血管完整性中的作用,目前称为炎症止血的过程〔31〕。血小板的止血和免疫调节功能都受到环境信号的严格调节,特别是它们与内皮和固有免疫系统成分的相互作用。血栓炎症的概念最初是用来描述血小板在减轻脑缺血再灌注损伤的炎症反应中的作用的〔32〕。目前,血栓炎症被更广泛地用于描述由血栓和炎症之间的串扰调节的各种疾病,如深静脉血栓、脑卒中和动脉粥样硬化及感染性疾病(如败血症)。血栓炎性疾病的共同特征是内皮细胞与免疫和止血系统的相互作用。在这些疾病中,炎症会引发血栓形成,而血栓形成反过来又会刺激炎症反应。血小板-白细胞相互作用在炎症实验模型和动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合征、缺血性脑卒中、深静脉血栓形成(DVT)和败血症患者的炎症内皮细胞、血栓和血液中的作用增强。

4.3血小板-中性粒细胞相互作用 血小板和天然免疫细胞之间的相互作用促进血栓形成、炎症和组织损伤。一些研究表明血小板在炎症条件下的中性粒细胞募集中的重要性,包括缺血再灌注损伤、急性肺损伤、动脉粥样硬化〔33～35〕。中性粒细胞在趋化因子、补体成分、炎症介质的作用下迅速从骨基质转移到炎症组织,血小板上的P-选择素与中性粒细胞膜上的PSGL-1相互作用在中性粒细胞的募集、巨噬细胞-1抗原(MAC-1)和淋巴细胞功能相关抗原(LFA)-1的激活及NETs的形成中起着重要作用〔36〕。MAC-1的激活也允许血小板与GPⅠb-α直接结合,并通过纤维蛋白原间接通过GPⅡbⅢa增加中性粒细胞的黏附和迁移〔37〕。这些相互作用在物理上加强了中性粒细胞和内皮细胞之间的桥梁,并诱导中性粒细胞下游信号传导,促进中性粒细胞黏附、爬行和迁移〔38〕。活化血小板表达上调可溶性或膜结合型 CD40L,与免疫细胞上的CD40相互作用并促进血栓和炎症〔39〕。此外,IL-8、c5a和其他激动剂与黏附血小板的相互作用增强中性粒细胞的活化〔40〕,并支持形成同型高栓塞聚集物。活化中性粒细胞与血小板的相互作用增加了sCD40L的释放,导致血小板和中性粒细胞产生的活性氧(ROS)增加。ROS和NETs支持血小板-中性粒细胞相互作用、血小板活化和血管炎症。血小板也表达血小板-中性粒细胞相互作用不需要的受体调节中性粒细胞的活动。例如,血小板上的触发受体表达的髓样细胞1配体增加了中性粒细胞效应器的功能,同时改变了血小板-中性粒细胞复合物。血小板免疫受体酪氨酸基激活基序(ITAM)受体钙离子依赖型凝集素样受体(CLEC)-2和血小板膜糖蛋白(GPVI)被证明调节血小板感染和炎症期间与中性粒细胞的相互作用〔41〕。