高通量测序技术在药用植物微生物多样性研究中的应用进展

韩霞，方佳丽，孟沈坤儿，朱晓尧，李楠，温海虹

(温州大学 生命与环境科学学院，城市水污染生态治理技术国家地方联合工程研究中心，浙江省水环境与海洋生物资源保护重点实验室，浙江 温州 325035)

药用植物是一类具有预防和治疗疾病效果的植物，具有极高的药用价值和经济效益[1]。在人类抗争疾病的长期历史进程中，药用植物发挥着至关重要的作用。中草药在我国有着悠久的发展历史，《神农本草经》、张仲景《伤寒杂病论》、李时珍《本草纲目》等都是我国历史文化的瑰宝。药用植物作为我国中药的重要来源，约占总量的90%，而80%药用植物为野生资源[2]。但由于目前野生药用植物被无序开发和生境变化，导致野生药材严重稀缺，再加上人工培育存在诸多问题，从而导致药用植物远不能满足市场的需求。

植物与微生物是一个息息相关的共生功能体。对于药用植物来说，与其相关的有益微生物可以促进药用植物的生长发育；抵抗高低温、干旱、盐渍等非生物胁迫；虫害、病害、杂草等生物胁迫以及影响次级代谢产物的生成和积累。因此，药用植物微生物很可能是植物健康和生产力的重要驱动因素。

随着生物技术的不断进步，尤其是高通量测序技术的迅猛发展，对药用植物微生物多样性的研究从微观形态学水平进入到了DNA测序水平。利用高通量测序研究药用植物微生物多样性对于提升药物产量和品质具有重大意义。

1990年，2个科研团队首次报道了从复杂环境样品中获得的一些16S rRNA序列，这是第一次打开地球上神秘的、未知的微生物世界的大门[3-4]。经过多年的探索，科学家又于1998年提出宏基因组(metagenome)的概念[5]，使微生物群落研究由特定基因克隆(16S rRNA、18S rRNA和ITS)向群体中全部微生物基因信息作为研究对象的转变。从2000年开始二代测序方法不断发展起来，将微生物群落高通量测序分析带入全新的阶段。2005年，454焦磷酸测序[6]，使微生物群落的分析由基于DNA的组学技术向高通量测序技术进阶；随着Illumina测序平台的问世，之后高达10余种序列组装算法以及各种软件的不断成熟，至此微生物群落研究飞速发展[7]。第三代测序平台是基于单分子水平的检测，具有长读长优势[8]。随着DNA测序技术的发展，研究人员发现，那些未获培养微生物的数量和种类远远超过了已获培养的，这展现了微生物的巨大多样性[9]。

药用植物具有丰富多样的微生物菌群，这些微生物在其生长发育、遗传、代谢功能中发挥着不可忽视的作用。因此，通过对药用植物微生物进行深入系统地研究可以加快对未培养微生物的开发和利用，提供关于其生理稳定性和功能的关键信息。目前，对药用植物微生物的高通量测序分析研究中大多采用二代和三代高通量测序技术。本文将简述高通量测序技术并介绍该技术近年来在药用植物微生物研究中的应用进展以及其使用高通量测序技术将要应对的挑战。

1 高通量测序技术简介

高通量测序(high-throughput sequencing，HTS)，又称为“下一代测序”(next-generation sequencing，NGS)或“深度测序”(deep sequencing，DS)，其特点为能一次性对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等[10-11]。它是相对于一代Sanger测序技术和焦磷酸测序技术革命性的转变，是一种新型技术，主要包括Roche 454焦磷酸测序平台、Illumina Solexa合成测序平台以及ABI SOLiD连接法测序平台，这些也被称为第二代测序技术[12]。它在保持高灵敏度和高精准度的同时，提高了测序速度并大大降低了测序成本。基于NGS的扩增子测序技术是目前在研究中最常用，也是文献报道最多的微生物高通量测序手段。它的原理是基于微生物基因组的特征性序列(如细菌的16S rDNA，真菌的18S rDNA和ITS等)进行分析微生物群落组成和多样性。但二代测序平台有读长的限制，在实际检测中无法使用高通量测序技术对扩增子整个基因全长进行测序。伴随着三代测序技术的进步，克服了二代测序读长短的劣势。因此，利用三代测序技术平台，以Pacific Bio[13]为主进行长片段的扩增和序列读取成为扩增子测序发展的活跃领域。由于三代测序具有成本低、周期短、通量高、精度准，读长长等优势，使得微生物基因序列全长测序成为可能，从而显著提高了基于Sanger测序和NGS测序技术所达不到的高水平物种鉴定的准确性、清晰度，以及对样品中微生物群落的高还原度。目前，高通量测序研究已检测到数万个分类操作单元(OTU)。大部分OTU在不同的分类水平上，甚至在门水平上都无法确定其分类地位，这也凸显了基于微生物扩增子的高通量测序方法在量化并评估微生物多样性方面的重要意义。微生物群落在驱动多种生态系统功能和生态过程方面发挥着核心作用，目前有越来越多的研究倾向于高通量测序技术分析微生物多样性。转录组测序[14](transcriptome sequencing，RNA-Seq)是指利用高通量测序技术进行cDNA测序，能够全面快速地获取某一物种某一状态下的几乎所有转录本。它具有无需参考物种基因组信息，仍可以进行转录组测序的优势。其测序结果可以反映特定条件和特定时间点的基因表达情况，对于挖掘其功能基因具有重要意义。另外，宏基因组测序[15]是利用二代测序技术或三代PacBio高通量测序平台对特定环境下微生物群体基因组进行高通量测序，在分析微生物遗传多样性、种群结构、进化关系的基础上，可进一步探究微生物群体功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系，发掘潜在的生物学意义。与传统微生物研究方法相比，宏基因组测序技术规避了绝大部分微生物不能培养、痕量菌无法检测的缺点，因此，近年来在微生物学研究中得到了广泛应用。与二代测序方法相比，三代宏基因组采用PacBio SMRT测序的长读长可以轻松覆盖基因区间或基因特异性区域，减少部分拼接错误，更真实反映菌群的复杂组成，有效提高微生物群落鉴定的分辨率，为深入功能研究奠定基础。

综上，随着NGS技术不断发展和成熟，尤其到了第三代测序技术，凭借其低成本、高通量、简流程和高灵敏性等特点，在微生物研究领域快速广泛地应用，成为当前探究微生物群落中的成员鉴定和理解微生物功能作用机制的有效手段，为微生物多领域的研究提供新的想法和途径。

2 高通量测序技术在药用植物微生物研究中的应用

2.1 物种和群落结构多样性

16S rDNA/18S rDNA/ITS/是微生物系统分类学研究中最适用和最常用的标志[16]。运用高通量测序技术检测药用植物中微生物(原核生物16S rDNA，真核生物18S rDNA和ITS)功能基因等特定区段，可以获得药用植物微生物物种丰度、物种分类、群落组成和进化关系。这些基因序列均包括可变区和保守区，保守区序列可以反映物种间的亲缘关系，而可变区序列则能体现物种间的差异。通过对这些序列可变区域的测定和比对可以探究并揭示药用中的优势物种、稀有物种及一些未知的物种，能真实地反映药用植物的微生物群落的组成情况。药用植物是已被用作治疗各种疾病的传统草药。然而，对这些植物的需求增加凸显了保护濒危物种的重要性。下一代测序(NGS)技术的重大进步加快了药用植物的研究。

刘蓬蓬等[17]首次通过基于Illumina MiSeq 平台的第二代高通量测序技术对中药黄芪中传统培养法和非培养法未检测到的及痕量内生细菌的种类进行宏基因组测序分析，准确、科学地探析了黄芪中内生细菌的多样性，为筛选目的功能菌种并进行微生物纯种或混合菌种发酵提供科学依据。另外，李莹等[18]基于Illumina MiSeq第二代高通量测序技术对野生甘松和人工栽培甘松的药用部位(干燥根及根茎，为汉藏药材)的内生细菌的16S rDNA V4～V5区进行序列测定，分析了甘松根际细菌和根及根茎内生细菌群落分布和多样性，筛选出核心功能微生物混合菌群，该研究对改良仿野生培育甘松土壤的微生物环境具有理论指导意义。刘丽等[19]运用高通量测序技术研究了3种类型一年生霍山石斛菌根真菌，深入了解其群落多样性、差异性及结构组成，为指导霍山石斛合理采收及应用提供依据。Wang等[20]提出用高通量测序技术指导传统培养分离药用植物内生菌的策略。利用高通量测序技术对药用植物内生菌结构组成和多样性进行整体了解，确定宿主的优势内生菌。然后根据各优势内生菌的特性模拟微生物原有生境然后设计合适的培养基进行分离培养，最后对分离菌株进行功能研究。2022年，Zuo等[21]利用高通量测序法分析了3种石斛品种(霍山石斛、铁皮石斛、串珠石斛)成熟期根际土壤中的微生物群落。在该研究中，研究人员从3种石斛属植物中总共获得了240 320个序列和11 179个OTU。该研究填补了石斛根际微生物群落的知识空白，为后续微生物功能挖掘和生物肥料研究提供了理论依据。高通量测序技术还应用在其他药用植物，如三七[22-23]、人参[24]、丹参[25]、北沙参[26]等微生物群落的多样性研究中。这些将为研究者全面认识药用植物微生物物种和结构多样性提供参考。

2.2 功能多样性

药用植物具有丰富多样和良好生物活性的次级代谢产物，如人参当中的人参皂苷、石斛中的多糖和生物碱、灵芝当中的三萜和多糖以及丹参当中的丹参酮等都被用作药用成分。研究发现，这些有活性的次级代谢产物的合成与药用植物微生物息息相关[27-29]。但这些次生代谢产物在植物体内含量较低，且绝大多数的生物合成途径并不完全清晰。再加上药用植物并不像模式植物那样具有完整的基因组信息和清楚的遗传背景。所以需要通过基于药用植物微生物转录组进行高通量测序，挖掘其内在活性成分生物合成相关的功能基因并分析其基因表达规律和功能调控机制。Wang等[30]对铁皮石斛根际和内球体样本进行16S rRNA扩增子测序和宏转录组测序，解析了铁皮石斛微生物群落多样性和代谢功能多样性。并通过多种数据库分析表明，碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢、遗传信息处理和环境信息处理等代谢途径显著富集，猜测这些可能与铁皮石斛在逆境中的生存有关。Zhong等[31]利用高通量转录组测序技术揭示了药用植物甘草微生物-代谢产物的综合调节模式。解析了野生型和栽培型乌拉尔甘草主要药性物质甘草苷和甘草酸的影响因素，分析了甘草根部代谢产物、基因表达与微生物群落之间的相关性。发现野生甘草的差异表达基因数量(DEG)高于栽培甘草的DEGs数量。而且功能富集分析表明，这些DEGs在与次级代谢产物(如类黄酮、苯丙烷和二萜)合成相关的功能方面显著富集，可能积极促进萜类和黄酮类化合物的合成和积累。Jo等[32]利用三代全长转录组测序技术对人参的根、茎、花和叶4种组织进行研究，产生了超过135 000个转录本，平均长度3.2 kb。该团队成功鉴定了与三萜皂苷合成，植物激素信号通路(包括生长素和细胞分裂素)等有关的特定全长基因，同时也鉴定了转座子为人参转录活性研究提供了依据。Li等[33]团队利用三代PacBio RS Ⅱ平台Iso-Seq方法对黄芪叶和根组织进行转录本测序，在叶中共得到27 975个转录本，在根中共得到22 343个转录本。除了得到更长的转录本、鉴定了新的同源异构体(isoform)以外，还鉴定了参与黄芪苷、胆钙素和毛蕊异黄酮苷生物合成的基因潜在的转录本。目前为止已经对很多药用植物进行了转录组测序研究，高通量测序技术凭借在没有获得物种的基因组信息的情况下仍可以进行转录组测序这个优势，被广泛应用在直接研究药用植物微生物功能多样性中。

2.3 遗传(基因)多样性

药用植物在基因水平上携带的各类遗传物质和遗传信息的总和是药用植物微生物多样性的本质和最终反映。传统微生物全基因组测序首先需要经纯培养，获得分离单一物种的DNA后才能进行全基因组测序。但是环境中存在着大量的不可培养微生物，而宏基因组可以对生境中所有DNA直接测序，通过生物信息学分析处理能够大大减少分离及纯化菌株的工作。药用植物微生物宏基因组高通量测序数据表明，不同药用植物种群间以及同一植物不同部位的遗传物质和基因表达具有巨大的差异[34-35]。这些差异对于药用植物未知和抗性基因筛选、药用活性成分代谢通路的解析、遗传多样性的研究和种质资源保护等方面具有重要意义。目前在二代和三代测序技术的结合下，研究者对药用植物微生物基因组研究有了新思路。Kui等[22]基于高通量宏基因组测序首次开展了三七在不同种植模式下的微生物结构和功能的研究，测序产生103.6 Gb的数据，得到1.64亿个单基因。该研究进一步对不同种植模式的三七根际微生物的核心功能进行分析，超过35%的单基因通过比对KEGG数据库，共注释了16 396个功能通路，这些通路主要与41个KEGG(2级)通路有关。该项工作为研究三七等人参属植物与根际微生物互作，栽培和育种提供了新的思路。Dong等[36]采用宏基因组高通量测序技术，分析了人参根际土壤真菌群落多样性及组成的变化，阐述了人参栽培模式对根际微生态的影响，为克服连作障碍提供策略。Wei等[37]应用宏基因组测序技术对不同区域的泽泻属中草药的根际微生物组的结构和功能进行了比较分析。重点关注了其结构和功能以及参与原甾烷三萜(protostane triterpenes)生物合成的基因。并且了解了主要的门是变形菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、酸杆菌门和芽单胞菌门。芽单胞菌属(Gemmatimonas)、厌氧黏细菌(Anaeromyxobacter)和假双头斧形菌属(Pseudolabrys)是不同地区潜在功能差异的主要因素。这项工作填补了泽泻根际微生物组的知识空白，为研究其有益微生物提供了宝贵的参考。Guo等[38]利用宏基因组测序技术对低中高3个水分处理(Group1、Group5和Group9)下的三七根际土壤微生物进行功能比较。基于KEGG、CAZy、CARD、ARDB、VFDB、NR、QS、PHI、P450等数据库注释结果证明，土壤水分变化会引起三七根际土壤微生物功能基因发生显著改变。该研究在大量田间和温室试验的基础上，综合利用三七根际土壤微生物高通量测序、宏基因组学和微生物培养组学等方法揭示了土壤水分通过调节土壤中有益和有害微生物菌群的平衡来影响三七根腐病发生的机制。因此，该研究为通过土壤水分管理来控制土传病害提供了新的策略。

由此可见，宏基因组高通量测序技术能够使我们更大程度地了解和掌握药用植物微生物的基因多样性和遗传背景信息，这对于药用植物活性成分生物合成途径的解析都具有极大的价值。

3 总结与展望

随着现代分子技术的发展，高通量测序技术能够以一种综合的方式研究微生物群落，能更具体地研究微生物群落的组成和分类特征及其功能特性。考虑到二代测序和三代测序结合使用在解析药用植物活性成分的生物合成途径和功能基因调控机制，以及药用植物的多样化分析和系统进化探究等重要方面上发挥的潜力，该技术有望成为探究药用植物与微生物之间关系的重要技术手段。这将把药物植物微生物基因组水平的研究带入新的高度，展现出不可替代的作用。然而，高通量测序技术的应用仍面临以下方面的挑战：一是微生物的高通量测序会伴随海量数据的产生[39]，处理这些海量数据需要与更多学科交叉研究，如数学、计算机学和信息学等；二是目前各种高通量测序技术在实验流程及分析过程中会出现方法间的偏差和未标准化等问题[40]，还需要进一步探讨和改进。因此，在选择使用高通量测序时，也要注意其局限性。

综上所述，虽然高通量测序存在数据分析难，技术方法偏差等问题，但因其有低成本、超高通量、简流程、高灵敏度和精度等特点，使其在药用植物微生物多样性研究中的应用具有优越性。因此，高通量测序是一个认知药用植物微生物多样性预测的有效技术手段。