基于矿物元素指纹分析地理标志的品牌腐乳产地溯源*

赵四标，张加稳，王 灿，陈 娴，刁玉华

(昆明市食品药品检验所 食品检验中心，云南 昆明 650034)

腐乳在我国有悠久的历史[1]，具有储存时间长、风味独特、食用方便、营养物质丰富等优点[2].这种发酵食品，以其低廉的价格、美味的口感而被广泛选用[3]，一直深受消费者的青睐.尤其是油腐乳，它以细腻的口感和香甜的滋味[4]，成为云贵川地区独具特色的发酵食品，深受当地人民的欢迎.牟定腐乳作为省级地理标志产品[5]，在云南辖区内知名度高，受众面广，但在流通过程中，品牌较多、工艺水平差异大、质量参差不齐等食品安全问题日益突出[6-8]，引起消费者和相关部门关注.

越来越多科研工作者通过产地溯源、产地保护、元素指纹鉴定等技术手段参与到地理标志产品和食品安全保护中.随着矿物元素指纹分析技术的发展，它已经成为一种重要的产地溯源手段，被广泛应用于各种农产品的生产之中.从马铃薯[9]、食用油[10]、葡萄酒[11]、蜂蜜[12]、茶叶[13]、大米[14-16]、大豆[17]、咖啡[18]、苦荞[19]等植物性农产品，到包括羊肉[20]、牛肉[21]、猪肉[22]在内的动物性农产品，都可以通过这种方式进行溯源，上述研究结果显示，基于矿物元素的分析技术在产地溯源、元素指纹鉴定等领域，具有科学性、准确性和普遍性，可以有效地帮助企业实现溯源目标.现有关于腐乳的研究主要集中在安全性[23]、微生物种群[24，25]、风味物质[26，27]、营养成分[28]及制作工艺[29，30]等方面，而关于矿物元素指纹分析应用于腐乳产地溯源尚未见相关报道.

本研究拟以不同产区不同品牌的31个腐乳样品为实验材料，通过矿物元素含量分析讨论，开展腐乳产地判别研究，建立适合于腐乳中矿物元素指纹分析的方法，为地理标志产品牟定腐乳开展产地判别、品牌鉴定及产地溯源保护提供一定的参考与依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

ICP分析用26种元素标准溶液，使用Bi、Ge、In、Li、Lu、Rh、Sc、Tb多元素标准溶液(内标液)(标液元素质量浓度分别为 100 μg/mL、10 μg/mL，标液介质为15%(V/V)HCl，5%(V/V)HNO3，2%(V/V)HF)；国家标准样品汞单元素标准溶液(以上标液来源于国家有色金属分析测试中心，浓度为 1 000 μg/mL，标液介质为 1 mol/L HNO3，唯一标识：211002-7)；硝酸(优级纯、川东化工)；过氧化氢；待测样品腐乳；超纯水(18.2 MΩ·cm).

1.2 仪器与设备

电感耦合等离子体质谱仪(厂家：赛默飞，型号：ICP-MS iCAP Q)、微波消解仪(厂家：安东帕、型号Multiwave PRO、聚四氟乙烯消解罐41支)、分析天平(梅特勒、型号AL104，感量为 0.000 1 g)、自动控温恒温电热板(BHW-09A45)、超纯水机(赛多利斯ariumbagtank 50)、高纯氩气(纯度>99.999%)、高纯氦气(纯度>99.999%).

1.3 方法

1.3.1 样品采集

随机采集3个产地，14个品牌的市售腐乳产品，共计31个样品，采样相关信息见表1.将随机采集的腐乳样品调制均匀待用.

表1 样品信息表

1.3.2 样品分析

为了准确地检测腐乳样品中各种矿物元素含量，按照现行国标GB 5009.268—2016[31]开展实验.称取 0.300 g 腐乳样品置于消解罐中，加入 7 mL 浓硝酸后放置过夜，之后按照GB 5009.268—2016第一法的升温方式进行消化处理，以确保消解完全.消解完成后，使用控温电热板 80 ℃ 赶酸 1.5 h，纯水定容至 50 mL，待测.使用经调谐后，各元素灵敏度、氧化物、双电荷各参数条件符合的电感耦合等离子质谱仪测定样品中Na、K、Ca、Mg、Zn、Fe、Cu、Mn、Ni、Ti、V、Cr、Cd、As、Se、Sr、Tl、Pb、Mo、Co、Sn、Sb、Ba、Hg 24种元素的含量，用外标法进行定量，通过三通在线添加内标进行校正.电感耦合等离子体质谱仪的工作条件参照GB 5009.268—2016附录B仪器参考条件B.1.检测过程中实时监测内标回收率在90%～110%之间，偏差高于±10%时，重新测定，单个腐乳样品采用连续重复测定3次后取平均值进行定值.

1.4 数据处理

使用Excel 2019与SPSS 19两种不同的数据处理软件，解析出不同的分析结果，包括方差分析、主成分分析、判别解析以及聚类分析.

2 结果与分析

2.1 方法学考察结果

对不同元素的线性方程、相关系数、相关标准偏差、检出限和定量限进行考察，见表2，结果显示：各种元素的标准工作曲线的线性关系好，相关系数R2均大于等于 0.999 5，检出限和定量限都很低，该检测方法科学、准确、可行，能够准确测定腐乳中24种元素含量.

表2 各元素的线性回归方程及相关参数

2.2 不同产地腐乳中矿物元素含量差异分析

不同产地腐乳中无机元素含量对比见表3，该表中均值是指同一产地中同一元素的含量平均值，先通过平均值算出标准差，再通过均值、标准差计算得到表4中的平方和、均方、F值和P值.P值是一个关键指标，根据表3、表4的数据可以看出，24种矿物元素中，有11种元素(Na、V、Cr、Mn、Fe、Zn、As、Se、Sn、Ba、Tl)的P值超过了0.05，这意味着它们之间的差异并不显著，而另外13种元素的P值则低于0.05，这意味着它们之间的差异显著，由此可见：腐乳中部分元素的含量会因地域不同而有显著的差异.

表3 不同产地腐乳中无机元素的含量对比 mg/kg

表4 不同产地腐乳中无机元素的含量方差分析结果统计

续表4

2.3 矿物元素含量主成分分析

主成分分析是指应用矿物元素含量数据基础上计算得到的初始特征值、提取平方和载入结果等参数，找出数据群体中主要影响因子，用数据群体中的少数关键性、特征参数、重要指标或单个因素可以用来代表数据群体中的其余众多指标或因素，从而将问题简化的一种多元统计分析方法[32，33].采集31个腐乳样品中矿物元素的主成分分析如表5所示，提取汇总数据中初始特征值大于1的成分作为基础数据进行成分分析研究，得到前8个主成分贡献率分别为17.439%、16.532%、15.377%、8.732%、6.941%、5.899%、5.681%、4.351%(表5)，筛选出的8个主成分的累积贡献率达到了80.957%，它们能够完整地展示、重现、描述各种来源的腐乳样本的各种元素的含量及其构成，从而更好地把握其本质特征.

通过对矿物元素的主成分分析，可发现了表6中的前8个主要因子，对这些因子进行了特征向量划分，以便更清晰地识别出其中的关键元素，目的在于能够更准确地分析出这些元素.

表5 腐乳样品中矿物元素含量的主成分分析

表6 腐乳样品中24种矿物元素的主成分贡献率分析 %

续表6 %

通过分析矿物元素的主成分，可以从表5中获取信息.按照张新昕[9]、鹿保鑫[34]的方法，一一挑选出腐乳样品中的各种元素.将第1个、第2个因子的载荷值分开，并将它们的绝对值分布在图1、图2上(原数据见表6)，以便更好地理解它们的特性.这些因子的载荷值有助于更准确地识别出各种元素，从而更好地分析出腐乳的组成成分.随着载荷值的增加，元素的方差贡献也会增加，从而使得分析结果更加准确.根据图1，Co、Cu、Cd、Hg、Sr、Sn、K、Na、Ca、Pb的载荷值均超过了0.40，表明这10个元素的载荷值相对更高，能够更好地反映第1个主成分的特征.K、Ca、Sr、Pb 4个重要的金属元素的载荷值绝对值不仅在第1主成分载荷值超过0.40，且在第2个主成分因子中介于0.48～0.75之间，值较大，4个元素也能够准确地揭示出第2个主要组成部分的含量.结合第1、2主成分因子的载荷值绝对值含量，Co、Cu、Cd、Hg、Sr、Sn、K、Na、Ca、Pb这10个元素不仅能提供有价值的区域性信息，而且还能提供有效的腐乳产地追踪依据.

图1 第1主成分因子载荷值的绝对值

图2 第2主成分因子载荷值的绝对值

2.4 不同产地腐乳矿物元素含量判别分析

2.4.1 不同产地腐乳矿物元素含量的判别和分类分析

通过对不同产地腐乳样品中24种矿物元素含量分析，可以准确识别云南省楚雄州牟定县、昆明市石林县、贵州省贵阳市三大主要食品产区的腐乳，利用Fisher函数、交叉检验，采取逐步判别法进行判别分析[15，33]，分析结果表明：楚雄牟定、昆明石林、贵阳判别正确率分别为100%、100%、96%，利用24种矿物元素之间的含量差异，可以将贵州省和云南省楚雄州两大生产区进行区分，以此实现昆明市石林县、楚雄州牟定县原产地的溯源，能够满足腐乳产品的溯源要求.

在产地判别应用中，如果同时测定24种矿物元素含量，对仪器设备、标准物质、试剂耗材等消耗较大，检测周期长，经济成本较高.为了更有效地识别产地，可使用SPSS软件的识别功能，筛选出有效的矿物物元素.在确保识别准确性的前提下，可采用逐步识别的方法来追踪不同地区的腐乳样品的产地.经过分析，发现6种元素被纳入了判别模型，它们分别是Co、Cu、Cd、Hg、Sr和Sn.经过回代检验，这些元素的正确判别率达到了93.5%，可以满足实际工作需求.根据这些元素的特性，建立了一个线性判别函数，具体系数参见表7.

表7 判别式分类函数系数

2.4.2 验证判别分析结果

为验证主成分分析的可靠性，采集楚雄牟定腐乳6份，贵阳腐乳2份，并将3个产区的31个腐乳样品的矿物元素数据以及用于判定的8份腐乳样品作为分组变量进行结果判别.通过判别6个矿物元素指标、6个判别组样品均判别准确，昆明石林、楚雄牟定2个产地样品存在错判率，交叉检验的错判率为3.3%小于10%，错判率较小，可以实现对腐乳产地判别的实际应用价值，证明6种矿物元素Co、Cu、Cd、Hg、Sr、Sn，对贵州贵阳和云南省内腐乳，以及楚雄牟定和昆明市石林生产的腐乳都具有有效的判别能力，可以很好地把楚雄牟定腐乳区分出来.

2.5 基于矿物元素含量的聚类分析

图3 不同腐乳产地的矿物元素聚类分析

使用SPSS 19.0软件，将不同产地的31个参试腐乳样品(包含14个腐乳品牌)中24种元素进行聚类分析，采用Ward聚类方法计算欧式距离，用最短距离法得到树状图[9]，结果如图3所示.以最小分类级别为分割线，所有样品可以分为6类，其中牟定与贵阳产地腐乳元素含量的欧式距离较远，被完全分离，其矿物元素组成差异较大，牟定与石林样品存在交叉现象，同时也发现牟定样品也被划分为5类，石林不同地区在矿物元素的组成上存在较大差异，证明了矿物元素的组成也可应用于石林不同品牌腐乳的品牌鉴别、产地区分.

3结论

通过对腐乳样品中矿物元素含量和组成进行分析，说明不同产地腐乳中不同矿物元素组成和含量均存在显著差异.使用Fisher函数和逐步判别分析法，可以准确地识别出腐乳中矿物元素含量，再通过对腐乳中矿物元素含量的方差分析、主成分分析、判别分析进行矿物元素特征指标确认，结合Ward聚类分析计算欧式距离，并使用最短距离法生成树状图.通过判别分析结果的验证，结果表明：

96.7%的样本中含有Co、Cu、Cd、Hg、Sr和Sn 这6种重要的金属元素，判别结果良好，可以作为楚雄州牟定县腐乳产地区分、品牌溯源的关键指标.本研究利用微波消解进行样品前处理，结合电感耦合等离子体质谱法同时测定腐乳中的24种矿物元素，由于腐乳加工工艺成熟，具有地域特色，影响因素较小，数据准确、结果可信度高、可行性强，故该技术可以作为腐乳的产地溯源和质量控制的有效指标，实现对腐乳的产地溯源、质量控制、特色地理标志食品的保护、真伪鉴别等目的.