胃癌类器官的研究进展*

杨涛,陈涛,刘礼鑫,刘康,夏术森

637000 四川 南充,川北医学院附属医院 胃肠外二科(杨涛、陈涛、刘礼鑫、夏术森);637000 四川 南充,南充市中心医院 组织工程与干细胞研究所(刘康)

胃癌是一种消化道常见的恶性肿瘤,其发病率与死亡率高,预后差,是全球人类生命健康安全的主要威胁之一[1]。胃癌发病率在全球癌症发病率中位居第5名,是全球第4大癌症相关死亡原因[2]。在我国癌症发病率中胃癌发病率位居第2名,死亡率居于第3位[3]。一项研究表明,仅2020年,全球就有770 000人死于胃癌[4]。目前胃癌的治疗是以手术为主的综合性治疗,化疗是其治疗的重要组成部分。但由于大多数患者在就诊时已是中晚期,加之肿瘤对化疗药物产生耐药性等原因,导致胃癌患者总体预后不佳,给人民生命健康及社会经济造成沉重负担。因此对于胃癌发生、发展机制的研究及药物精准化治疗迫在眉睫。患者来源的肿瘤类器官(patient-derived organoid,PDO)保留了原肿瘤的组织结构特点,可反映出原肿瘤的特异性,并且PDO模型还具有遗传稳定性,因此可用来评估患者对临床治疗的特异性反应[5],进而为患者的个体化治疗方案提供依据[6]。PDO因其独特的特点,可在临床工作前进行药物实验,避免了复杂且耗时的动物实验。这大大地促进了肿瘤患者个体化治疗方案的实施,在临床治疗及科学研究方面具有重要意义。本文就胃癌类器官的建立及其当前的研究进展,结合胃癌类器官的特点为胃癌的个性化治疗提供新的研究思路。

1 类器官概述

过去胃癌的研究模型包括标准细胞系模型、动物模型、人源肿瘤细胞系移植模型及人源肿瘤组织异种移植模型等。二维培养的细胞系模型因获取方便、培养过程简单、成本低廉等特点,已广泛运用于各种科学实验中。但在连续的传代和外界刺激因素的作用下,其染色体发生变异,原癌特性丧失,并且缺乏原癌组织的三维结构,导致无法表达出原癌组织的结构特性[7]。动物模型组织结构与人器官结构差异过大,并且无法模拟疾病的转化发生过程,极大地限制了其在科研工作中的运用及价值[8]。肿瘤异种移植模型是将肿瘤细胞或组织植入小鼠体内,尽可能地模拟了原发肿瘤在生理状态的肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)中的变化。但由于物种及遗传信息的差异,研究中无法准确还原肿瘤在人体内的相互作用情况,并且构建模型难度较大,花费较高,极大地限制了其在研究中的运用[9]。类器官是干细胞在三维空间结构中的特定培养体系下自我驱动组装形成的可在体外增殖、分化的3D结构的细胞复合体,其细胞结构、功能及基因组特性与原组织器官高度一致,因此常常用于器官的发育、肿瘤的发病机制、药物筛选与开发、精准医疗等领域的研究。但是由于类器官的培养过程较复杂,培养周期较长且成本较高,其在科研中的应用受限。不过随着培养技术的进步,类器官的培养及在科研方面的运用也越来越广泛。类器官的干细胞主要来源于多能干细胞(pluripotent stem cells,PSC)和器官限制性成体干细胞(organ-restricted adult stem cells,ASCs),其中前者包括多能诱导干细胞和胚胎干细胞。PSC的分化方向具有不确定性,因此PSC来源的类器官可以根据研究人员的需要,在培养时通过添加不同组织类器官培养所需的生长因子或抑制剂来诱导干细胞沿着类似于器官发生发育的方向发生逐步分化,最终分化成研究人员所需的类器官用于实验。PSC来源的类器官的培养过程较复杂、周期长、成本高并且成功率较低,主要用于研究器官生成与组织发育。ASCs来源的类器官通常直接取自已分化的人体组织或患者的病变组织,通过添加能够维持组织正常信号调控的生长因子,使其发展成为类器官。ASCs来源的类器官培养周期短、培养过程简单并且成功率高,通常用于组织生物学的研究,是目前最常用的类器官培养方式[10]。PDO可以较好保留来源肿瘤组织的异质性,成为肿瘤相关研究可靠的研究模型。因此胃癌患者来源的类器官在我们探索胃癌的发病机制、研究胃癌基因变化特点、胃癌患者治疗药物的研发、胃癌患者个体化治疗等领域有着重要的价值[11-12]。

2 胃癌类器官的建立

患者来源的胃癌类器官的培养是将手术切下的肿瘤组织、内镜获取的肿瘤组织或转移的肿瘤组织放入到消化培养基中消化,获取胃癌干细胞,当在镜下可观察到单个的细胞或小细胞团时终止消化[13-14],避免因过度消化导致细胞活性降低。将获取的干细胞与基质胶按一定比例混合重悬,然后加入含有各种生长因子的培养基[15-16]。经过3～4天时间,发展成由胃干细胞、黏液细胞、主细胞、壁细胞和内分泌细胞所包围的球囊结构。类器官通过不断地增殖与传代,用于相应的试验检测或者冷冻备用[17]。目前胃癌类器官还可通过小鼠来建立。Seidlitz等[18]构建了不同亚型的胃癌转基因小鼠,经过培养发现来源于不同基因亚型的小鼠胃癌类器官对不同药物有明显的耐药性,这说明了小鼠胃癌类器官用于医学研究是具有可行性,同时也证明了胃癌类器官的来源可以是多样化的(图1)。

图1 胃癌类器官是干细胞在三维培养环境中培养形成的球囊状结构

3 胃癌类器官的应用

目前胃癌类器官主要应用领域包括探究胃癌的发病机制、临床用药指导、模拟TME、药物筛选与开发(图2)。

图2 胃癌类器官的常见应用领域包括基础研究和作为临床疾病模型

3.1 探索胃癌的发生机制

探索在肿瘤发生过程中起到关键作用的基因及其功能,对于揭示胃癌的发生有非常重要的意义。过去一般通过细胞系或转基因小鼠来研究肿瘤相关基因及其功能。转基因小鼠试验一般花费的时间较长、成本高,并且无法进行连续试验,试验过程很难把控。肿瘤细胞系试验采用标准化的细胞系,细胞基因构成复杂且有大量的变异基因,难以分离出单个基因进行研究,因此不太适用于肿瘤发生机制的研究。但肿瘤类器官可弥补以上不足,用于研究肿瘤的发生机制。国内研究学者[19]通过胃癌腹水成功建立腹水来源的胃癌类器官,发现胃癌患者腹水的上清液可以激活腹水来源的胃癌类器官和胃癌细胞的Wnt/β-catenin信号通路,且胃癌类器官的生长与Wnt/β-catenin信号通路的激活呈正相关。进一步研究发现,当Wnt信号存在时,Axin/APC/GSK-3β复合物将会被Dishevelled 蛋白所抑制,使得β-catenin无法被磷酸化降解,非磷酸化β-catenin将被转运入核,调节靶基因的表达。根据STAT3激活可增加β-catenin在细胞核中的定位,因此推断出STAT3信号通路与Wnt/β-catenin信号通路可能在促进胃癌细胞的生存和转移过程中起协同作用。日本学者[20]通过基因技术结合人胃上皮类器官探究了胃癌发生过程中有关基因的影响。CDH1又名上皮细胞钙粘连素,是一种重要的细胞黏附相关基因,在维持上皮形态功能方面具有重要意义,除此之外还发挥抑癌基因功能。研究者采用 CRISPR-Cas9技术将CDH1基因敲除后,发现正常胃类器官由“管状”变为“实心球状”,这与人类低分化弥漫型胃癌组织学形态类似。除此之外,细胞的运动能力在CDH1基因敲除后明显增强,这也符合弥漫型胃癌中的癌细胞的特征。为了进一步研究,研究者敲除了CDH1下游基因CTNNA1,类器官的变化与CDH1基因敲除后的变化一致,最终证实了CDH1基因在胃癌的发生中起到关键作用。除此之外,有研究通过构建胃癌类器官,并在胃癌类器官中过表达环状RNA NRIP1(circRNA NRIP1,circNRIP1)。发现circNRIP1通过吸附miR-149-5p来调节胃癌细胞中AKT1的表达,进而调节胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭行为。当circNRIP1在人胃癌组织中显著上调时,circNRIP1吸附 miR-149-5p 促进胃癌细胞中AKT1的表达,导致胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力增强。并且还发现circNRIP1可以通过胃癌细胞之间的外泌体通讯传播,并且外泌体circNRIP1可以进一步促进体内肿瘤转移。这表明circNRIP1在胃癌的发生和向远处转移的过程中起到重要的促进作用,提示circNRIP1在未来可能成为治疗胃癌的重要靶点,为胃癌的治疗提供了新的思路[21]。综上所述,胃癌类器官用于胃癌发病机制的研究是具有重要价值的。

3.2 胃癌类器官用于临床用药指导

日本学者利用胃癌类器官详细地研究了EGFR通路[20],证明了EGFR通路在临床治疗中的意义。EGFR是重要的肿瘤通路,具有靶向治疗价值。研究者通过构建胃癌类器官,发现单个ERBB3或PTEN突变的胃癌类器官在没有生长因子EGF和FGF10的环境中无法生长,但是ERBB2或ERBB3扩增的胃癌类器官则可以在没有EGF和FGF10的环境中生长。使用ERBB激酶抑制剂处理后,发现大部分ERBB基因扩增型胃癌类器官的增殖受到抑制。除此之外,一些ERBB基因组没有发生改变且能在缺乏EGF和FGF10的环境中生长的胃癌类器官,它们却对ERBB激酶抑制剂敏感。通过基因组学分析发现,可能是因为这些类器官能够自分泌 Epireg-ulin的原因,导致了这一现象的发生。同时研究还发现,MET扩增的胃癌类器官对MET抑制剂克唑替尼敏感。德国学者根据全基因组测序所得的基因突变及药物靶点信息研究发现,ERBB2扩增的类器官对抗ERBB2抗体曲妥珠单抗反应良好;c-KIT基因突变的类器官对伊马替尼较为敏感;CDKN2A缺失的类器官则对靶向细胞周期的CDK4/6抑制剂palbociclib明显耐药[12]。香港的学者通过培养对5-氟尿嘧啶和顺铂具有耐药性的胃癌类器官进行研究发现RNA编辑酶1(ADAR1)在胃癌类器官中上调,增加了SCD1 mRNA稳定性,而SCD1会促进脂滴的形成,减轻化疗诱导的内质网应激,并通过增加 β-连环蛋白的表达来增强自我更新,从而对5-氟尿嘧啶和顺铂产生抗性。揭示了ADAR1/SCD1轴可作为预测化疗预后效果的指标,这可为临床患者筛选敏感化疗药物提供新的思路[22]。Steele等[6]建立了7例胃癌患者来源的类器官, 基因测序结果显示胃癌患者来源类器官的基因组信息与原肿瘤组织高度相似。采用临床常用化疗药物表阿霉素、奥沙利铂以及5-氟尿嘧啶等对构建的胃癌类器官进行干预, 并将干预结果与患者本人对这几种化疗药物的治疗效果进行比较,发现两者的结果走向基本一致。除此之外,另有研究表明患者的放化疗反应与肿瘤类器官对化疗药物的反应是高度匹配的,准确性为84.43%,敏感性为78.01%,特异性为91.97%。这些研究表明类器官可以预测肿瘤特异性反应的强度[23],证明了患者来源的胃癌类器官可帮助临床医生预测患者个体对化疗药物的敏感性,进而为患者制定更加有效的个体化治疗方案,提高治疗的针对性,最大限度地延长患者的生存期[24-25],这对胃癌患者的治疗具有非常积极的作用。以上研究结果充分表明胃癌类器官可在临床治疗工作中起到重要的指导作用。

3.3 探索胃癌与TME之间的联系

TME是指肿瘤的发生、生长及转移时所处的内外环境,主要由肿瘤细胞、基质细胞、免疫细胞、内皮细胞等组成,与肿瘤发生、发展以及药物反应密切相关[26]。二维培养的细胞系无法表征肿瘤细胞间的信号传导及联系,无法模拟出TME在肿瘤发生、生长及转移过程中所发挥的作用。肿瘤动物实验能够模拟出TME,但是难以对微环境中某单一因子进行调控,并且物种差异过大[27],故在研究TME方面存在缺陷。已知细胞程序性死亡受体1(programmed cell death protein-1,PD-1)和程序性细胞死亡配体1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)之间的相互作用可以抑制CD8+细胞毒性T细胞的增殖、存活及其功能。癌细胞通过表达与免疫细胞上的PD-1相互作用的PD-L1来逃避免疫监视,进而导致癌细胞增殖。Chakrabarti等[28]通过将免疫细胞与小鼠来源的胃癌类器官进行共培养模拟胃癌微环境,研究PD-1与PD-L1之间的相互作用。最终目标是使肿瘤类器官/免疫细胞共培养作为临床前模型来预测个体患者的免疫治疗效果。众所周知,胃癌是由多种因素作用下导致的恶性疾病,其中幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,HP)感染被认为是诱导胃癌发生的首要独立危险因素[29]。经典的散发性胃癌致病学说认为,HP感染胃黏膜后可引起慢性胃炎、胃黏膜萎缩、肠上皮化生,最终导致胃癌的发生。过去的细胞系实验无法培养出胃壁细胞和黏液腺细胞,而HP感染后主要病理改变为壁细胞脱落,因此过去的实验模型难以用于探索HP感染胃粘膜导致胃癌发生的具体过程。胃类器官可弥补细胞系的不足,为研究HP感染导致胃癌发生提供有效研究模型。研究人员将HP微注射入胃类器官空腔中,模拟胃感染HP后宿主细胞与细菌间的相互作用,成为揭示HP诱发胃黏膜免疫炎症反应、腺体萎缩机制以及炎癌转化过程演变规律的有力工具[30-31]。另有研究表明,只有一小部分感染了HP的人会发生胃癌,这可能是由于遗传因素和/或宿主、微生物和环境决定因素之间的特定相互作用导致的结果。研究人员通过利用胃类器官与HP共培养实验,发现携带毒力因子的细胞毒素相关基因a(cagA)的HP菌株与缺乏cagA基因的HP菌株相比,会极大地增加胃癌发生的风险。其可能的原因是CagA与ASPP2(p53-2的凋亡刺激蛋白)的结合会使感染的细胞易于失去其细胞极性并获得由CagA与Par1b的相互作用促进的EMT样表型,最后导致胃癌的发生[32]。综上,胃癌类器官用于探索胃癌与TME之间的关系以及揭示HP感染在胃癌发生过程中所导致的病理变化是具有重要意义的。

3.4 药物筛选与开发

过去药物筛选主要通过传统肿瘤细胞培养和人源肿瘤异种移植(patient-derived tumor xenograft,PDTX)。传统的二维肿瘤细胞无法模拟出肿瘤组织结构与TME的动态变化,缺乏机体与细胞之间的相互作用,其数据可靠性不高。PDTX可以模拟出机体与细胞间相互作用过程,但是构建模型过程复杂,耗时长,成本高,并且存在物种差异,限制了其在药物筛选领域的使用。肿瘤是一种复杂且高异质性的疾病,因此建立生理、病理以及临床药物反应层面与肿瘤患者相近的模型, 对于药物潜在效果的评估以及对患者自身救治的有效性等至关重要[33]。PDO可保留肿瘤的遗传信息特点及生理、病理特异性,因此肿瘤类器官可以更准确地反映出这些癌症的遗传特征来弥合体外和体内模型之间的差距[34],建立大型肿瘤类器官生物库作为活体生物库并结合药物筛选可能是未来肿瘤新的治疗策略[35]。除此之外类器官构建时间短、花费低,有效性高,并且适合基因操作,是大规模高通量药物筛选及新药开发的理想模型[36]。Seidlitz等[12]将5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康、多西他赛和表柔比星分别作用于胃癌类器官,并记录了胃癌类器官对每种药物的反应情况。发现ERBB2基因扩增的1例 PDO仅在高浓度时对5-氟尿嘧啶显示出反应,且仅对伊立替康无抗性,在其他药物作用下时无明显反应,表现出明显的抗性。Li等[37]用恶性腹腔积液肿瘤细胞建立了11个胃癌转移的胃癌类器官,用奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、顺铂、多西他赛、 伊立替康、表柔比星和紫杉醇对胃癌类器官进行药物筛选,每种药物以6个不同浓度进行作用,测试药物的半数抑制浓度,判断药物的敏感性。结果显示,对于胃癌恶性腹腔积液和胃癌转移性疾病都能成功地用类器官进行药物筛选。另有研究人员通过将胃癌类器官与免疫细胞共培养进行实验,发现抑制HER2过表达导致PD-L1表达减少,可以减少肿瘤细胞免疫逃避。结果证明了靶向HER2的药物可以通过降低PD-L1的表达从而创造一个有利于肿瘤免疫治疗的环境[38]。以上实验结果表明,用肿瘤类器官进行药物筛选对于肿瘤患者的个性化治疗具有重要价值。

4 胃癌类器官的优缺点

胃癌类器官相较于其他研究模型而言,其主要的优点在于其具有前瞻性、精准性及高效性。类器官作为近10年来最热门的医学研究领域之一,科研人员对其进行了大量的研究,使其成为临床前肿瘤相关研究的理想模型,已有大量研究人员通过培养胃癌类器官用于揭示胃癌发生的机制及制定个体化的治疗方案。另外胃癌具有高度异质性,不同患者对同一药物的敏感性不同并且患者经过药物治疗后会对之前敏感的药物产生耐药性,因此治疗前对患者进行药物敏感性测试是非常有意义的。传统的药物筛选方式因其自身缺陷导致筛选出的药物价值低且成本高昂,除此之外测试周期也很长,导致临床运用受到极大的限制。胃癌类器官作为药物筛选模型,不但建模时间短,并且准确性高,能表现出患者对药物的真实反映,在精准医疗方面具有极高的价值。

虽然胃癌类器官这项新兴技术相较于传统的细胞系模型和动物模型有一定优势,但是也存在一些不足之处。主要的不足之处包括类器官的培养方式及技术问题、共培养问题、微环境组成问题等。第一,目前对于胃癌类器官的培养方式及后期类器官质量评估方面国内外没有统一标准,导致不同实验室有不同的标准,使得后期的研究结果存在偏差。除此之外,与其他肿瘤不同,胃癌类器官的培养成功率相对较低,在胃癌类器官的既往文献报道中成功率较高的也仅仅只有50%左右[39];第二,由于胃癌类器官主要由主细胞、壁细胞、干细胞及多种内分泌细胞所构成,缺乏神经、血管及机体内的免疫细胞和寄生细菌,在探究胃癌细胞与TME间的相互作用时需进行共培养,由于培养体系存在差异,进行共培养时不同培养体系间存在干扰。除此之外将胃癌类器官与TME共培养时间是有限的,如何解决共培养间的干扰和长期培养问题是亟待解决的;第三,目前类器官技术难以完全重现机体内部复杂的生理调控过程[40],如何培养出具有血管、神经系统的形体更大、结构功能更复杂的胃癌类器官也是亟待解决的问题。但随着生物技术的发展进步,我们可以通过三维生物打印技术利用各种生物材料来完成人类设计的三维骨架的构建[41]。因此,3D生物打印技术可以人为控制类器官的3D结构,这为未来类器官的运用提供了技术支持。

5 展 望

胃癌类器官可以在体外模拟出胃癌在体内的动态病理变化。通过向胃癌类器官空腔中注射HP,模拟出宿主细胞与寄生细菌间的相互作用,在探究HP在胃癌发生过程中所扮演的角色方面有重要意义。胃癌类器官不但具有保留原癌的特异性,并且能够维持基因组的稳定性,因此可作为探究胃癌的发病机制,筛选个体化治疗药物,模拟机体内TME的重要工具,为临床的靶向治疗及精准治疗提供有效的指导意义。此外,胃癌类器官的构建成本低并且能够大规模培养,在高通量药物筛选方面具有难以比拟的优势,这在解决临床耐药问题及新药研发方面具有重要价值。当然,胃癌类器官也有不足之处,相信随着技术的成熟完善,在肿瘤机制的研究及指导精准治疗领域胃癌类器官将得到广泛的应用。

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