链格孢菌DT-XRKA菌株的除草活性及对作物的安全性

程海洋 程亮 朱海霞 李娟 魏有海 郭青云

摘 要 从青海省大通县达隆村农田采集自然感病的植物叶片并分离出真菌菌株，以密花香薷为靶标草，通过离体叶片和温室盆栽试验以及作物安全性评价，筛选获得1株具有较好除草活性的生防菌DT-XRKA。结果表明，离体叶片接种DT-XRKA 7 d后，密花香薷叶片上出现产3～4倍于菌饼大小的灰褐色病斑，病斑面积达到了整个叶片的50%以上，在接种处可见大量灰褐色的菌丝，中心黑色，边缘褐色，且叶片开始逐渐失绿变黄，病级达到5级。不同浓度（1.47×101～1.47×104个/mL）的DT-XRKA孢子悬浮液对密花香薷的发病率达到67.84%～96.42%，病情指数为51.11～97.97，鲜质量防效达到52.44%～82.67%。作物安全性评价结果表明，DT-XRKA菌株孢子悬浮液对油菜、白菜、番茄、黄瓜和辣椒安全。经形态学特征和rDNA-ITS序列分析将DT-XRKA鉴定为链格孢Alternaria alternata。

关键词 杂草；除草活性；作物安全性；生物防治

密花香薷（Elsholtzia densa Benth.）为唇形科香薷属1 a生草本植物，别名咳嗽草、野紫苏、萼果香薷等，是中国重要的蜜源植物和药用植物，也是提取香精的主要材料之一[1-2]。主要分布于甘肃、青海、西藏及新疆等地，同时也是麦类作物田和油菜田的主要恶性杂草之一[3]。密花香薷的防除多依靠化学除草剂，但长期、大量使用化学除草剂，致使农田杂草的抗药性水平迅速提高，已对国内农田杂草防控和粮食安全造成严重威胁[4]。基于全球环境意识和人类健康要求，开发高效，低毒，无污染的新型除草剂，已成为目前的主要任务和重中之重。近年来，微生物除草剂因具有对环境污染小，资源丰富等优点[5]，被人们广泛关注，且已经取得了一定成果。

链格孢（Alternaria alternata）可防除的杂草范围较广，Siddiqui等[6]将含有107个/mL的  A.alternata分别喷施于2～3叶期和4～5叶期的藜（Chenopodium album），可使藜的生物量显著降低90%。王禹博[7]将孢子浓度为2.0×106  个/mL的A. alternata SC-018喷施于1～2叶期的野慈姑（Sagittaria trifolia），能造成90%以上的野慈姑死亡。Bohra等[8]将107和108  个/mL的A. alternata喷施在10～30 d叶龄的假海马齿（Trianthema portulacastrum）其植株的死亡率达到100%。Abbasi等[9]将含有104～105  个/mL的A. alternata接种于苜蓿（Medicago sativa）幼苗 5 d后，叶片和茎部出现坏死斑，最终导致植株死亡。Kaspary等[10] 将含有106个/mL的A. alternata接种于皱叶酸模（Rumex crispus），叶片出现严重浅棕色斑点，最终变成不规则的深棕色病变。Mira等[11]将1×106个/mL的A. thunbergiae接种于4～6叶期的翼叶山牵牛（Thunbergia alata）幼苗8 d后，叶片表现出深褐色病斑，并形成大面积坏死区。Mohammad[12] 将105个/mL的A. alternata孢子悬浮液接种于  2～3叶期的稗草（Echinochloa crusgalli）幼苗，48 h后叶片出现长条形褐色病斑，并对稗草种子萌发具有较强的抑制作用。Bozoglu等[13]将  1×104个/mL的A. crassa分离株EUCC-22081的孢子悬浮液接种于曼陀罗（Datura stramonium）幼苗，15 d后40%的植株死亡。另外，链格孢产生的次生代谢产物利用方面，A. alternata产生的毒素细交链孢菌酮酸在对恶性杂草马缨丹（Lantana camara）具有较强的生物杀草活性[14]。Meena等[15]报道将链格孢菌株次生代谢产物用于防除银胶菊（Parthenium hysterophorus），在全浓度培养滤液处理下，对其种子萌发、幼苗根长和茎长的抑制率达到27%、51%和45%。Tang等[16]报道将来自Alternaria sp.的毒素Alternariol和Altenuisol在对反枝苋（Amaranthus retroflexus）研究中，当浓度达到1 000 μg/mL时，使其根长减少68.1%和51.0%。

目前，利用链格孢菌对密花香薷的除草研究报道较少。仅有朱海霞等[17]初步研制Alternaria tenuissima HZ-1可湿性粉剂，对密花香薷等其他阔叶杂草的除草作用进行了研究。然而，本研究以密花香薷为研究对象，评价Alternaria alternata DT-XRKA菌株的除草活性及对作物的安全性，旨在为微生物除草剂开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

病样采集：2021年7月从青海省大通县达隆村采集自然感病的瓜叶葵（Helianthus cucumerifo）植株叶片，将不同病部组织叶片分类装于  无菌自封袋中，编号后置于冰箱以4 ℃保存，  备用。

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然，121 ℃灭菌30 min。

杂草和作物种子：密花香薷种子采集于试验地成熟密花香薷植株上。作物种子购买于西宁佳农种子有限责任公司。

试剂：3%次氯酸钠、75%乙醇和吐温-80。

1.2 病原菌的分离纯化

参照方中达[18]的方法。从植物叶片的病健交界处切取5 mm×5 mm的小塊组织，依次在75%乙醇中和2%次氯酸钠水溶液中浸30 s，灭菌水冲洗3次，于PDA培养基上，28 ℃恒温培养3～5 d，从菌落边缘挑取少量菌丝再次纯化后保存于PDA试管斜面中，备用。

1.3 孢子悬浮液的制备

取PDA上培养7 d的菌株，用移液枪吸取  5 mL的无菌水转移至培养基平板上，然后用灭菌接种铲刮取平板菌落于无菌离心管中，并向离心管中补加无菌水至10 mL，拧紧管盖，摇晃混匀，在振荡器中充分振荡，确认孢子均匀无明显分层。然后用纱布过滤，制成孢子悬浮液，并用血球计数板计数。

1.4 离体叶片致病性测试

采集新鲜无病虫密花香薷杂草叶片，用于离体叶片致病性测试。叶片经75%乙醇消毒处理并晾干后正面向上置于垫有2层无菌滤纸的培养皿中（d＝9 cm），加无菌水1.5 mL湿润滤纸，将d=8 mm的菌饼菌丝生长旺盛的一侧紧贴叶片正面，以接无菌的PDA培养基块为对照，每处理重复3次。置于25 ℃光照培养箱中保湿培养，接种7 d后调查叶片发病情况。参照文献[19]按如下标准记载发病情况：1级，无病或者几乎无病；  2级，叶片上出现少量的病斑（病斑面积少于总叶面积的1/3）；3级，病斑面积占总叶面积的1/3～  1/2；4级，病斑面积占总叶面积的1/2～2/3；  5级，叶片几乎全部发病。

1.5 温室盆栽试验测试

密花香薷种子用1%的 NaClO消毒3 min，无菌水冲洗3次，25 ℃催芽至露白，播种于营养钵中，每盆30株，出苗后保留20株。待密花香薷幼苗长出 4～6片真叶后，喷雾接种各真菌菌株孢子悬浮液（浓度为104个/mL，含0.5 mL吐温-80），接种量为30 mL/盆。以清水加0.5 mL吐  温-80作为对照。每处理重复3次。接种后幼苗置于温度（25±1） ℃，RH（60±10）%，光周期L/D=16 h/8 h环境下，常规方式管理。于接种后7 d观察发病情况，计算发病率、病情指数和鲜质量防效。参照文献[19]进行病情分级。1级，无病或者几乎没有病；2级，叶片上有零星的斑点；3级，1/4以上的叶片出现病斑，植株生长受到抑制；4级，2/3以上的叶片出现病斑，植株生长受到严重抑制；5级，3/4以上的叶片出现病斑，植株将近死亡或死亡。

发病率=发病植株数/调查植株总数×100%

病情指数=Σ（病级株数×对应级数）/（调查总株数×最高级值）×100

鲜质量防效=（对照组鲜质量-处理组鲜质量）/对照组鲜质量×100%

1.6 不同浓度的菌株DT-XRKA孢子悬浮液对密花香薷的致病性测定

利用“1.3”中的方法配备菌株DT-XRKA孢子悬浮液，然后梯度稀释至浓度为1.47×101、  1.47×102、1.47×103个/mL以及1.47×104个/mL的孢子悬浮液。参照“1.5”的方法对密花香薷进行致病性测定。

1.7 作物安全性评价

将作物种子用1%的NaClO消毒后，25 ℃催芽至露白，播种于培养钵中，每钵点播20粒种子，覆土厚度约为1 cm。待长至3～4叶期时，用浓度为1.47×104个/mL的DT-XRKA孢子悬浮液接种，接种量为30 mL/盆。每个处理重复  3次，对照组以清水加0.5 mL吐温-80进行喷施。接种后将幼苗置于温度（25±1） ℃，RH  （60±10）%，光周期L/D＝16 h/8 h环境下，常规方式管理。接种7 d后观察作物发病情况，计算发病率和病情指数。病情分级标准参照文献[20]并稍加修改。1级：无症状，植株叶片无任何病斑；  2级：轻微反应，植株叶片上有零星病斑分布；  3级：中等感病，植株1/4～1/2的叶片死亡，生长受抑制；4级：严重感病，植株1/2～3/4叶片死亡，生长较严重受抑制。当0≤病情指数＜5时，安全性等级为安全无症状（no symptom，NS）；当5≤病情指数＜10时，安全性等级为轻微反应（lightly susceptible，LS）；当10≤病情指  数＜50时，安全性等级为中等感病（moderately susceptible，MS）；当病情指数＞50时，安全性等级为严重感病（severely susceptible，SS）。

1.8 病原菌的鉴定

1.8.1 形态学鉴定 将菌株DT-XRKA在PDA平板培养基上进行培养，培养过程中观察菌落形态，在光学显微镜下观察菌丝和分生孢子以及是否在PDA培养基上产生色素沉着，同时参考《真菌鉴定手册》对其进行鉴定[21]。

1.8.2 分子生物学鉴定 DT-XRKA采用真菌DNA提取试剂盒提取其菌株DT-XRKA基因组DNA，分别采用引物ITS1/ITS4和Alt a 1-F/Alt a 1-R（表1）对该菌株基因组的核糖体DNA内转录间隔区（ITS）和链格孢菌过敏原基因（Alt a1）基因序列进行扩增。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。25 μL反应体系：2×PCR  Master Mix12.5 μL、10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL、50 ng/μL DNA模板1.0 μL、ddH2O补足25 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，阳性样品送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，将测序所得序列提交GenBank并进行BLAST序列同源性比对，采用MEGA 7.0软件以邻接法构建系统发育树，进行1 000次bootstraps检验，比较生防菌株与其他近缘菌株的亲缘关系。

1.9 数据分析

利用SPSS 18.0軟件对试验数据进行统计分析，采用Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 离体叶片致病性测定结果

采用组织分离法，从自然感病的植物叶片中分离获得真菌7株，编号分别为DT-04A2、DT-YSB1、DT-XRKA、DT-DYLC、DT-14A2、DT-08C和DT-QKBD004A。以密花香薷为靶标杂草，采用离体叶片法对7株真菌进行致病性测定。菌饼致病性测定结果表明：接种7 d后，7株菌株对密花香薷离体叶片均表现不同的致病性。菌株DT-DYLC接种后，接种部位出现褐色病斑并向外逐步扩展，中心腐烂，有明显的褐色轮纹病斑，病斑覆盖面积占整个叶面积的40%左右，病级为4级。菌株DT-XRKA接种后，接种部位中心黑色，边缘褐色，并逐步向菌饼四周呈放射状扩散，病斑面积达到菌饼的3～4倍，发病面积占叶面积50%以上，病级为5级。菌株DT-YSB1、DT-QKBD004A、DT-08C和DT-14A2接种后，接种部位逐步变黄失绿，菌丝开始逐步侵染，接种部位出现褐色病斑，并逐渐向外扩展，病斑面积为菌饼大小，病级为2级。菌株DT-04A2接种后，叶片出现少量的不规则病斑，病级为1级。

2.2 温室盆栽防效结果

如图1所示，喷施DT-DYLC菌株孢子悬浮液后7 d，密花香薷上部植株叶片出现病斑，生长受到抑制。发病率为69.38%。喷施DT-XRKA菌株孢子悬浮液后，密花香薷叶片由叶缘向中心，逐步出现深浅不一的褐色病斑，植株下部叶片布满病斑部分植株发病枯死，生长受到严重抑制。接种7 d后，3/4以上的叶片出现深褐色病斑，发病率为88.97%。喷施DT-QKBD004A和DT-08C菌株孢子悬浮液后，叶尖部分发病枯萎植株出现萎蔫现象，生长受到抑制。发病率为  55.82%和58.33%。喷施DT-YSB1和DT-04A2菌株孢子悬浮液后，植株叶片出现零星的斑点，对密花香薷的致病作用不明显。发病率仅为19.89%和33.51%。喷施DT-14A2菌株孢子悬浮液后，密花香薷叶片出现零星病斑，病斑面积逐步扩展，7 d后，2/3以上的叶片出现病斑，植株生长受到严重抑制。发病率为80.54%。

结合发病率、病情指数和鲜质量防效综合分析（表2），接种7株菌株孢子悬浮液对密花香薷致病力不同。菌株DT-XRKA、DT-14A2与DT-DYLC、DT-08C、DT-QKBD004A、DT-04A2、和DT-YSB1发病率和病情指数相比，差异显著  （P＜0.05），鲜质量防效菌株DT-XRKA与其他5株菌株相比差异显著（P＜0.05）。综上，由离体叶片致病性和盆栽致病性测试结果发现，7株菌株对密花香薷的致病性高低排序为：DT-XRKA＞DT-14A2＞DT-DYLC＞DT-08C＞DT-QKBD004A＞DT-04A2＞DT-YSB1，筛选出对密花香薷致病性最好的菌株为DT-XRKA。在接下来的试验中，将以菌株DT-XRKA作为防除密花香薷的优势菌株，进行后续试验研究。

2.3 菌株DT-XRKA不同孢子悬浮液浓度对密花香薷的盆栽防效

由图2可见，喷施菌株DT-XRKA孢子悬浮液7 d后，   1.47×104个/mL浓度处理的密花香薷植株将近全部死亡。孢子悬浮液浓度为  1.47×103个/mL处理的植株叶片发黄，茎秆倒伏，发病部位主要集中于根部和中部叶片，3/4以上植株发病枯死，植株生长受到严重抑制。  1.47×102个/mL浓度处理的植株有部分叶片出现褐色病斑并有逐步扩大迹象，部分叶片出现卷曲死亡现象并伴随倒伏，生长受到抑制。而  1.47×101个/mL孢子悬浮液浓度处理的幼苗部分叶片失绿，发病枯萎，1/4上的叶片出现斑点，有倒伏现象，生长受到抑制。

由表3可見，1.47×104个/mL浓度孢子悬浮液对密花香薷发病率、病情指数和鲜质量防效分别达96.42%、97.97和  82.67%，1.47×101个/mL孢子悬浮液对密花香薷的发病率、病情指数和鲜质量防效分别为  67.84%、51.11和  52.44%。1.47×104个/mL处理的发病率与其他3个浓度处理相比，达到显著差异（P＜0.05）。在病情指数和鲜质量防效比较，1.47×104  个/mL与1.47×102个/mL和  1.47×101个/mL处理相比，达到显著差异（P＜  0.05）。

2.4 作物安全性测试

将浓度为1.47×104个/mL的菌株DT-XRKA孢子悬浮液喷在测试作物上，接种7 d后，调查作物的发病情况，结果如图3和表4所示。油菜与对照相比，在长势和叶色上均无症状，植株叶片无任何病斑发病率和病情指数为0，安全等级为NS；豌豆和蚕豆有轻微卷叶现象，植株叶片上有零星病斑分布，发病率为10.73%和10.16%，安全等级为MS；对小麦和青稞有轻微的致病性，在接种的叶片顶端有少量梭形黄斑，叶片有轻微发黄现象，后期病斑不扩展，发病率为19.45%和30.55%，安全等级为MS；玉米与对照相比，叶尖部位有少量梭形黄斑，叶片有轻微卷叶现象，后期病斑不扩展，发病率和病情指数为5.76%和  9.77，安全等级为LS；白菜、番茄、黄瓜和辣椒与对照相比，在长势和叶色上均无症状，植株叶片无任何病斑发病率和病情指数为0，安全等级为NS；菠菜植株1/2以上的叶片出现病斑，叶片失绿变黄，植株生长受到抑制，发病率和病情指数为53.18%和51.46，安全等级为SS；萝卜植株3/4以上的叶片出现病斑，植株生长受到严重抑制，发病率和病情指数为72.63%和74.18，安全等级为SS。

2.5 病原菌鉴定

2.5.1 形态学鉴定 菌株在 PDA培养基上，菌落白色，中间褐色，背面中间灰褐色，边缘不规则，呈放射状，稀松，菌落表面凹凸不平，菌丝毛绒状，质地较薄（图4-a）。菌丝灰白色，具横隔膜，有分支（图4-b）。分生孢子褐色，倒棍棒状，具3～6个横隔膜，1～3个竖隔膜，长10～30 μm，宽2～6 μm（图4-c）。根据形态学特征，将分离的病原菌初步鉴定为链格孢属Alternaria sp.。

2.5.2 分子生物学鉴定 扩增获得DT-XRKA菌株的ITS和Alt a1序列长度分别为545 bp和422 bp，GenBank登录号为OP404082和OP413739。基于ITS基因序列的系统发育分析结果表明，DT-XRKA菌株与多株Alternaria alternata相似性达到99%，并与登录号为OP161643.1和ON827299.1的Alternaria alternata系统发育树的最小分支（图5-A）。基于Alt a1基因序列的系统发育分析结果表明，DT-XRKA菌株与登录号为MW308146.1的处于系统发育树的同一最小分支（图5-B）。结合其形态学特征及基于ITS基因序列的系统发育分析结果，将DT-XRKA鉴定为链格孢菌（Alternaria alternata），命名为A. alternata DT-XRKA。

3 结论与讨论

开发和利用微生物资源作为生物除草剂，是微生物研究的重要目的之一[22]。植物病原菌产生的代谢产物在杂草防治中发挥着巨大的作用，从植物病原菌中生产生物除草剂是已被证实控制杂草最有效的方法之一[23]。TeA是从Alternaria属和其他致病菌分离研制而出的微乳液，主要用来防除紫荆泽兰、马唐草、反枝苋和旱莲等多种植物，具有较高的除草活性[24]。CASST是从Alternaria cassiae J.和A. Khan配置的制剂，对于控制大豆和花生作物田中的决明子效果显著[25]。另外將狭卵链格孢菌AAEC05和苋链格孢菌-3等比例混合成孢子粉，对大豆田中四叶龄以下的稗草和反枝苋的防除效果可达到70%[26]。本研究以密花香薷作为靶标杂草通过离体叶片测定进行初筛，从7株真菌中筛选到具有生防潜力的1株真菌，然后通过盆栽试验进行复筛，筛选到1株对密花香薷防除效果较好的菌株DT-XRKA，该菌株对密花香薷的鲜质量防效达到  85.99%。

确定使用范围是高效开发生物除草剂的重要步骤[27]。除草剂候选菌株的主要标准是对广泛的杂草具有致病性，同时对作物具有安全性[28]。本研究对测试作物进行安全性评价发现菌株DT-XRKA孢子悬浮液对油菜、白菜、番茄、黄瓜和辣椒安全，可以在以密花香薷为优势杂草的黄瓜、十字花科和茄科田中安全使用。然而本研究仅对12种作物进行了安全性评价，下一步有必要对其他作物的安全性进行研究，以确定其安全性水平和寄主范围。

Alternaria物种由于其世界性的性质和对大量植物引起疾病的能力，在农业生产中变得越来越具有重要的意义[29]。已报道用于农田杂草防除的链格孢菌种类主要有A. sonchi、A. alternata、A. pellucida、A. macrospora以及  A.cassiae等[30-33]。本研究通过形态学特征和分子生物学鉴定，最终确定菌株DT-XRKA为Alternaria alternata。

微生物对寄主杂草的生物防治能力受生理、形态、生态相互作用和环境因素的影响[34]。本研究在控制环境下对菌株DT-XRKA的生物防治效果进行了评价，但是还需要进一步研究菌株DT-XRKA作为生物除草剂的潜力，包括田间药效评价和环境因素对病原菌链格孢菌防治杂草作用的影响。

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Herbicidal  Activity and Crop Safety of Alternaria alternata DT-XRKA

Abstract Fungal strains were isolated from the leaves  of naturally diseased plants collected from the farmland of Dalong village，Datong county，Qinghai  province. Among these strains，the antagonistic strain DT-XRKA exhibited effective herbicidal activities against Elsholtzia densa through detached leaves，greenhouse pot experiments，and crop safety evaluation. The results showed that grayish-black patches covering more than 50% of leaf area appeared on the detached leaves after 7 days inoculation，resulting in 3-4 times more than fungus plugs. Massive grayish-black hyphae with concentric blackish and brown margins were observed at the inoculation sites. As the disease progressed，chlorosis and the yellowish area increased，reaching a disease grade of 5. The spore suspension of strain DT-XRKA，with different concentrations ranging from 1.47×101  to  1.47×104 spores/mL，exhibied an incidence rate of 67.84% to 96.42%，a disease index ranging from 51.11 to 97.97，and a fresh  mass  control effect between 52.44% and 82.67%. Crop safety evaluation of strain DT-XRKA showed that its spore suspension was safe to rape，cabbage，tomato，cucumber and pepper. DT-XRKA was identified as Alternaria alternata by  morphology and rDNA-ITS sequence analysis.

Key words Weeds; Herbicidal activity; Crop safety; Biological control