基于网络药理学和分子对接探讨张氏腰痛方治疗腰椎间盘退变的作用机制

陈杨达豪 劳杨骏 徐彬 徐卫星 张树良 盛红枫

【摘 要】目的：基于網络药理学和分子对接的方法探讨张氏腰痛方治疗腰椎间盘退变（LIDD）的分子生物学机制。方法：通过检索数据库，筛选张氏腰痛方的活性成分和作用靶点，以及LIDD的相关基因。通过R软件筛选张氏腰痛方治疗LIDD的共同靶基因，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络以及共同靶基因的蛋白质相互作用网络，同时挖掘网络中潜在的蛋白质功能模块。关键靶基因进行GO功能富集分析与KEEG通路富集分析，以揭示这些靶基因的潜在生物学功能和通路。结果：共筛选出202个有效成分和164个共同靶基因，包括10个核心靶基因。富集分析结果表明，张氏腰痛方治疗LIDD的靶点主要作用于晚期糖基化终产物及其受体（AGE-RAGE）信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、细胞凋亡和低氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路等。这些生物过程主要参与炎症反应、氧化应激和细胞凋亡的调控。分子对接结果显示，张氏腰痛方治疗LIDD的主要活性成分divaricatol、槲皮素、O-乙酰基哥伦比亚苷元、紫堇灵、黄芪紫檀烷苷与核心靶点TNF、AKT1、白细胞介素-6、TP53、血管内皮生长因子A具有良好的结合能力。结论：本研究初步证实了张氏腰痛方治疗LIDD具有“多成分、多靶点、多通路”的特点，主要从抗炎、抗氧化应激、抑制细胞凋亡和自噬等方面发挥对LIDD的治疗作用。

【关键词】 腰椎间盘退变；张氏腰痛方；网络药理学；靶点预测；分子对接

Exploring the Mechanism of Zhang's Waist Pain Formula in Treating Lumbar Intervertebral Disc

Degeneration Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

CHEN Yang-da-hao，LAO Yang-jun，XU Bin，XU Wei-xing，ZHANG Shu-liang，SHENG Hong-feng

【ABSTRACT】Objective：Based on network pharmacology and molecular docking methods，this study aims to explore the molecular biological mechanism of Zhang's Waist Pain Formula in the treatment of lumbar intervertebral disc degeneration（LIDD）.Methods：By searching the database，the active ingredients and targets of Zhang's Waist Pain Formula，as well as the related genes of LIDD，were screened.Software R was used to screen common target genes of Zhang's Waist Pain Formula.A "drug-component-target-disease" network and a protein interaction network with common target genes were constructed，while exploring potential protein functional modules in the network.GO functional enrichment analysis and KEEG pathway enrichment analysis on key target genes were performed to reveal their potential biological functions and pathways.Results：A total of 202 active ingredients and 164 common target genes were screened，including 10 core target genes.The enrichment analysis results indicate that the targets of Zhang's Waist Pain Formula in treating LIDD mainly act on AGE-RAGE signaling pathway，TNF signaling pathway，cell apoptosis，and HIF-1 signaling pathway.These biological processes are mainly involved in the regulation of inflammatory response，oxidative stress，and cell apoptosis.The molecular docking results showed that the main active ingredients of Zhang's Waist Pain Formula for treating LIDD，including divaricatol，quercetin，O-acetylcolumbidin，corynoline，and Isomucronulatol 7-O-glucoside have good binding ability with core targets TNF，AKT1，interleukin-6，TP53，and vascular endothelial growth factor A.Conclusion：This study preliminarily confirms that Zhang's Waist Pain Formula has the characteristics of "multiple components，multiple targets，and multiple pathways" in the treatment of LIDD，mainly playing a therapeutic role in anti-inflammatory，antioxidant stress，inhibition of cell apoptosis，and autophagy.

【Keywords】 lumbar intervertebral disc degeneration;Zhang's Waist Pain Formula;network pharmacology;

target prediction;molecular dockings

腰痛是成年人腰背部疾病最常见的症状［1］，腰椎间盘退变（lumbar intervertebral disc degenera-tion，LIDD）是导致腰腿疼痛最常见原因之一［2］。LIDD的发生机制仍不完全清楚［3］，针对LIDD的治疗方法仍有局限性。保守治疗效果有限，而手术治疗存在并发症的风险［4］。此外，这些治疗手段既不能延缓椎间盘的退变进程，也不能对退变椎间盘进行再生修复。因此，亟需新的治疗方案，帮助延缓或者预防LIDD的发生。

中医学对LIDD有独到深刻的认识，多将其归为“腰腿痛”“痹证”范畴，认为LIDD主要由肾精亏虚、风寒湿邪、外伤劳损引起［5］。张氏骨伤始于清道光年间，是我国中医骨伤重要学术流派之一，并入选国家第三批“非物质文化遗产”保护项目。张氏腰痛方为张氏骨伤治疗腰腿痛的常用经验方，具有补肝肾、祛风寒湿、活血化瘀之效，临床疗效显著［6］。

网络药理学在中药方剂研究上应用广泛，其以生物信息学和系统生物学为基础，研究药物、靶点、疾病之间的复杂关系，探索多种药物的协同效应，符合中药方剂成分多、靶点多、途径多的特点［7］。因此，基于网络药理学原理与方法，本研究探析张氏腰痛方的中药药物成分与疾病靶点的对应关系，预测各种可能的调控机制，为该方治疗LIDD的后续实验研究提供理论依据。

1 方 法

1.1 张氏腰痛方活性成分及作用靶点筛选 通过TCMSP（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform）［8］和TCMID（Traditional Chinese Medicine Integrated Database）［9］数据分析平台检索张氏腰痛方中各个药物的活性成分。筛选条件为：口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18。将预测得分 > 0的靶标作为药物靶点。

1.2 相关靶点的筛选及网络构建 以“intervertebral disc degeneration”“lumbar interver-tebral disc degeneration”作为关键词，在OMIM、Disgenet、Genecards数据库中进行检索，获得疾病相关靶点。应用Venny2.1软件作图工具平台将筛选出的关键靶点绘制韦恩图，取两者交集后获得药物-疾病共同靶点。使用Cystoscap 3.8.2软件构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图。使用Network Analyzer对网络图进行拓扑分析。

1.3 蛋白相互作用（PPI）网络构建及核心靶点分析 使用STRING数据库检索药物-疾病共同靶点，设置条件：蛋白种类为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值 = 0.4。应用Cytoscape软件绘制PPI网络图，并进行拓扑分析，选取大于平均分的基因作为核心靶点，将前30个靶点绘制成条形图。

1.4 核心靶点基因功能和通路富集分析 进行关键靶基因GO功能富集分析与KEGG通路富集分析，设置条件为P值 < 0.05，Q值 < 0.05，根据结果绘制条形图和气泡图。

1.5 分子对接验证 分析“药物-成分-靶点-疾病”网络图与PPI网络图，根据度值大小筛选核心靶点和核心化合物进行分子对接。采用AutoDock Tools软件对核心化合物配体和蛋白受体进行处理和对接，计算分子结合能。

2 结 果

2.1 张氏腰痛方治疗LIDD关键靶点筛选 对张氏腰痛方中18味中药有效成分进行筛选，去重后，共得到潜在活性成分202个。取预测得分 ﹥0的靶标作为药物靶点，去重后，筛选出1093个药物靶点。去重后，共获得LIDD靶点1204个。在Venny2.1平台上输入药物及疾病靶点，绘制韦恩图，获得药物-疾病共同靶点164个（见图1），即为张氏腰痛方治疗LIDD的潜在靶点。

2.2 中药-成分-靶点-疾病网络构建及分析 将张氏腰痛方中202个潜在活性成分与164个药物-疾病共同靶点绘制成“药物-成分-靶点-疾病”相互作用网络图（见图2）。

2.3 PPI网络构建及核心基因分析 将164个药物-疾病共同靶基因导入STRING数据库中进行检索，绘制PPI网络图，包括164个节点，2452条边（见图3）。通过度值排序，将前30个靶点使用R 3.6.1绘制条形图（见图4），前10位包括TNF、AKT1、白细胞介素（IL）-6、TP53、血管内皮生长因子A（VEGFA）、STAT3、EGFR、HIF1A、JUN、MAPK3。使用MCODE模块进行PPI网络基因簇分析并筛选核心基因，得到5个基因簇（见图5）。前两个基因簇包含前10位核心基因。

2.4 核心靶点基因功能和通路富集分析 将164个共同靶基因经R语言运行后行GO分子功能分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析共确定2798个条目，其中生物学过程通路相关的条目2545个，主要涉及与氧化应激相关的反应，如对氧化应激的反应、对氧气水平的反应、对氧气水平下降的反应，及对缺氧的反应；细胞组分相关的条目82个，主要涉及膜筏、膜微区、膜区等方面；分子生物功能相关的条目171个，主要涉及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性、肽鏈内切酶活性、跨膜受体蛋白激酶活性、酪氨酸蛋白激酶活性、磷酸酶结合等方面。并对每个类别前20个条目进行可视化分析，见图6（1）、6（2）、6（3）。将张氏腰痛方治疗LIDD涉及的164个共同靶基因经R语言运行后得到160条KEGG通路，其中前20的结果形成KEGG功能富集的条形图，见图7。有意义的通路包括与糖尿病并发症有关的晚期糖基化终产物及其受体（AGE-RAGE）信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、细胞凋亡和低氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路等。

2.5 分子对接结果 选取张氏腰痛方的核心化合物divaricatol（MOL011740）、槲皮素（MOL000098）、O-乙酰基哥伦比亚苷元（MOL003608）、紫堇灵（MOL004198）、黄芪紫檀烷苷（MOL000380）与核心靶点TNF、AKT1、IL-6、TP53、VEGFA进行分子对接，得到分子结合能。通常认为结合能的数值 ﹤-5.0 kcal·mol-1时，表明两者之间具有较好的结合活性，﹤-7.0 kcal·mol-1时，表明两者具有强烈的结合活性［10］。本研究结果显示，核心化合物与核心靶点的结合能均﹤-5.0 kcal·mol-1，具有较好的结合活性。其中O-乙酰基哥伦比亚苷元与TNF、TP53、VEGFA的结合能分别为-7.02 kcal·mol-1、-7.15 kcal·mol-1、-7.66 kcal·mol-1，紫堇灵与AKT1、VEGFA的结合能分别为-7.69 kcal·mol-1、-7.77 kcal·mol-1，均 ﹤-7.0 kcal·mol-1，表明O-乙酰基哥伦比亚苷元和紫堇灵与TNF、TP53、AKT1、VEGFA结合能力强，在张氏腰痛方治疗LIDD中可能发挥重要作用，具有潜在的研究价值。

3 讨 论

LIDD是一个慢性且不可逆的过程，主要病理特征是蛋白多糖和水分的丢失、细胞外基质降解增多、神经血管向内生长和分解代谢细胞因子表达的增加［11-14］。虽然LIDD发生的病因及机制尚未明确，但已有证据表明，炎症和氧化应激反应在其中扮演着关键角色［15-16］。目前，包括非甾体抗炎药和肌肉松弛剂在内的药物治疗在LIDD中应用广泛，对于缓解疼痛具有一定的作用，但无法延缓或者逆转椎间盘退变［17-18］。中医药治療包括“腰腿痛”“痹证”在内的各种疾病已有数千年的历史。现代研究发现，中医药可以通过减少炎性介质和因子的释放、减轻氧化应激和抗凋亡作用等机制延缓LIDD的病程［19］。

本研究发现，在张氏腰痛方中起主要治疗作用的活性成分包括divaricatol、槲皮素、O-乙酰基哥伦比亚苷元、紫堇灵、黄芪紫檀烷苷等。在以往的研究中发现，防风中色原酮类化合物divaricatol能够抑制炎症因子表达并且可以通过提高痛阈值达到一定的镇痛作用［20］；槲皮素为本方中多味中药的共同有效成分，可抑制髓核细胞凋亡，防止细胞外基质变性，减缓LIDD的进展［21］；独活中的O-乙酰基哥伦比亚苷元能够抑制多种炎性因子活性，从而达到抗炎和延缓LIDD的效果［22］；延胡索中的紫堇灵已被证实可以保护细胞免受炎症的影响，降低细胞中iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β的因子水平［23］，并可使NF-κB失活发挥抗炎作用［24］。因此，推测张氏腰痛方可能通过防风、独活、延胡索等诸多药物配伍、协同发挥抗炎和抗氧化应激的作用，从而抑制细胞凋亡和自噬，阻止椎间盘的退变。

通过对共同靶基因PPI网络的分析，发现TNF、AKT1、IL-6、TP53、VEGFA、STAT3、EGFR、HIF1A、JUN和MAPK3可能是张氏腰痛方治疗LIDD的主要靶点。TNF通过诱导退变的椎间盘产生多种促炎细胞因子，进而加重椎间盘的炎症反应，加速细胞凋亡［25-26］；可通过刺激多种基质金属蛋白酶的表达，降低胶原和聚集素水平，促进髓核退变［27］。STAT3可通过调节MMP-2的表达增加细胞外基质的降解［28］。IL-6可通过诱导细胞氧化应激和干扰铁稳态，导致软骨细胞内铁死亡，从而引起细胞程序性死亡，促进椎间盘退变［29-30］。VEGFA可以促进新生血管形成和浸润性病变，协同P53基因加速椎间盘的退变［31］。对张氏腰痛方和LIDD共同靶点的分子功能进行GO富集分析的结果也表明，其核心靶点的分子功能主要涉及氧化应激和炎症反应方面。张氏腰痛方干预LIDD的主要信号通路是AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、细胞凋亡和HIF-1信号通路等，这些通路参与诱导椎间盘细胞肥大和成骨分化、椎间盘细胞凋亡，从而加速椎间盘的退变［32-33］。

然而，本研究也存在一定的局限性。例如，只通过数据库筛选活性成分和相关基因可能不够全面。此外，这项研究的结果缺乏体外试验验证，后续将在此基础上进行进一步的动物实验或细胞实验验证，进而明确张氏腰痛方的主要调控机制。

参考文献

［1］ KNEZEVIC NN，CANDIDO KD，VLAEYEN JWS，et al.

Low back pain［J］.Lancet，2021，398（10294）：78-92.

［2］ OICHI T，TANIGUCHI Y，OSHIMA Y，et al.Pathomechanism of intervertebral disc degeneration［J］.JOR Spine，2020，3（1）：e1076-e1084.

［3］ LUO LIWEN，JIAN XIUYING，SUN HUI，et al.Cartilage endplate stem cells inhibit intervertebral disc degeneration by releasing exosomes to nucleus pulposus cells to activate Akt/autophagy［J］.Stem Cells，2021，39（4）：467-481.

［4］ XU WB，RAN BB，LUO WQ，et al.Is lumbar fusion necessary for chronic low back pain associated with degenerative disk disease？a Meta-analysis［J］.World Neurosurg，2021（146）：298-306.

［5］ 李满意，刘红艳，陈传榜，等.腰痹的证治［J］.风湿病与关节炎，2022，11（4）：49-52，71.

［6］ 赵睿晞.方证数据挖掘分析张氏骨伤对腰椎间盘突出症的辨证用药规律［J］.陕西中医药大学学报，2016，39（6）：44-46.

［7］ LUO TT，LU Y，YAN SK，et al.Network pharmacology in research of Chinese medicine formula：methodology，application and prospective［J］.Chin J Integr Med，2020，26（1）：72-80.

［8］ RU JL，LI P，WANG JN，et al.TCMSP：a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines［J］.J Cheminform，2014，16（6）：13-18.

［9］ HUANG LIN，XIE DUOLI，YU YIRAN，et al.TCMID 2.0：a comprehensive resource for TCM［J］.Nucleic Acids Res，2018，46（1）：1117-1120.

［10］ HSIN KY，GHOSH S，KITANO H.Combining machine learning systems and multiple docking simulation packages to improve docking prediction reliability for network pharmacology［J］.PLoS One，2018，8（12）：e83922-e83930.

［11］ URBAN JPG，ROBERTS S.Degeneration of the intervertebral disc［J］.Arthritis Res Ther，2003（5）：120-130.

［12］ KEPLER CK，PONNAPPAN RK，TANNOURY CA，et al.

The molecular basis of intervertebral disc degener-

ation［J］.Spine J，2013，13（3）：318-330.

［13］ RISBUD MAKARAND V，SHAPIRO IRVING M.Role of cytokines in intervertebral disc degeneration：pain and disc content［J］.Nat Rev Rheumatol，2014，10（1）：44-56.

［14］ DE GEER CM.Cytokine involvement in biological inflammation related to degenerative disorders of the intervertebral disk：a narrative review［J］.J Chiropr Med，2018，17（1）：54-62.

［15］ CHE HUI，LI JIE，LI YOU，et al.p16 deficiency attenuates intervertebral disc degeneration by adjusting oxidative stress and nucleus pulposus cell cycle［J］.Elife，2020，9（3）：e52570-e52592.

［16］ SAMPARA P，BANALA RR，VEMURI SK，et al.Understanding the molecular biology of intervertebral disc degeneration and potential gene therapy strategies for regeneration：a review［J］.Gene Ther，2018，25（2）：67-82.

［17］ MAHER C，UNDERWOOD M，BUCHBINDER R.

Non-specific low back pain［J］.Lancet，2017，389（1）：736-747.

［18］ 楊超强，张虎林，汪小敏，等.间充质干细胞来源外泌体治疗椎间盘退变的机制研究进展［J］.风湿病与关节炎，2023，12（5）：66-70.

［19］ ZHU LG，YU CHS，ZHANG XF，et al.The treatment of intervertebral disc degeneration using traditional Chinese medicine［J］.J Ethnopharmacol，2020，29（5）：113117-113128.

［20］ 陈雨秋，张涛，陈长宝，等.防风的化学成分、提取工艺及药理作用研究进展［J］.江苏农业科学，2021，49（9）：43-48.

［21］ WANG D，HE X，WANG D，et al.Quercetin suppresses apoptosis and attenuates intervertebral disc degeneration via the SIRT1-autophagy pathway［J］.Front Cell Dev Biol，2020，10（8）：613006-613020.

［22］ JEONG HJ，NA HJ，KIM SJ，et al.Anti-inflammatory

effect of Columbianetin on activated human mast

cells［J］.Biol Pharm Bull，2009，32（6）：1027-1031.

［23］ YANG CJ，ZHANG CY，WANG ZB，et al.Corynoline isolated from corydalis bungeana turcz.Exhibits

（下轉第36页）

（上接第6页）

anti-inflammatory effects via modulation of Nfr2 and

MAPKs［J］.Molecules，2016，21（8）：975-989.

［24］ 张浩，李木子，翟晓婷，等.紫堇灵的分离制备及抗炎活性［J］.中国药科大学学报，2017，48（6）：715-720.

［25］ BRENNER DIRK，BLASER HEIKO，MAK TAK W.Regulation of tumour necrosis factor signalling：live or let die［J］.Nat Rev Immunol，2015，15（6）：362-374.

［26］ KOERNER JD，MARKOVA DZ，SCHROEDER GD，et al.

The effect of substance P on an intervertebral disc

rat organ culture model［J］.Spine（Phila Pa 1976），

2016，41（24）：1851-1859.

［27］ YANG SHAOFENG，LI LINGHUI，ZHU LIGUO，et al.

Aucubin inhibits IL-1β- or TNF-α-induced extracellular matrix degradation in nucleus pulposus cell through blocking the miR-140-5p/CREB1 axis［J］.J Cell Physiol，2019，234（8）：13639-13648.

［28］ JI ML，LU J，SHI PL，et al.Dysregulated miR-98 contributes to extracellular matrix degradation by targeting IL-6/STAT3 signaling pathway in human intervertebral disc degeneration［J］.J Bone Miner Res，2016，31（4）：900-909.

［29］ LIANG H，YANG X，LIU C，et al.Effect of NF-κB signaling pathway on the expression of MIF，TNF-α，IL-6 in the regulation of intervertebral disc degeneration［J］.J Musculoskelet Neuronal Interact，2018，18（4）：551-556.

［30］ BIN S，XIN L，LIN Z，et al.Targeting miR-10a-5p/IL-6R axis for reducing IL-6-induced cartilage cell ferrop-tosis［J］.Exp Mol Pathol，2021，118（1）：104570-104578.

［31］ FREEMONT AJ，WATKINS A，LE MAITRE C，et al.Nerve growth factor expression and innervation of the painful intervertebral disc［J］.J Pathol，2002，197（3）：286-292.

［32］ ILLIEN-J?NGER S，TORRE OM，KINDSCHUH WF，et al.AGEs induce ectopic endochondral ossification in intervertebral discs［J］.Eur Cell Mater，2016，32（18）：257-270.

［33］ ZHANG J，WANG XL，LIU H，et al.TNF-α enhances apoptosis by promoting chop expression in nucleus pulposus cells：role of the MAPK and NF-κB pathways［J］.J Orthop Res，2019，37（3）：697-705.

收稿日期：2023-09-25；修回日期：2023-11-08