甜菊糖甙的测定方法

于聪敏，石岩

(青岛农业大学旱作技术山东省重点实验室，青岛266109）

综述

甜菊糖甙的测定方法

于聪敏，石岩

(青岛农业大学旱作技术山东省重点实验室，青岛266109）

对目前甜菊糖甙测定方法进行了综述，并比较了容量法、重量法、流动注射化学发光法、分光光度法、毛细管电泳法、高效液相色谱法、薄层色谱法之间的差异性和优缺点。目前应用最广泛的测定方法是高效液相色谱法。

甜叶菊；甜菊糖甙；测定方法

甜菊糖甙是一种具有甜味的萜烯类配糖体，分子式为C38H60O18，分子量为803，其纯度在90%以上为白色粉末，纯度在80%～90%之间为微黄色粉末。目前，从甜叶菊中分离出来的甜菊糖甙共有8种[1]，其中占最主要的是Stevioside成分[1，2]，约占总量的60%～70%，甜度约为蔗糖的300倍，余味长而微苦如青草。其次是Rebaudioside A，约15%～20%，甜度为蔗糖的450倍，甜味最接近蔗糖。其他组分含量都较少。甜菊糖甙在人体内不参与代谢，不产生热量，作为一种非糖、非营养型的甜味剂，不仅符合现代健康饮食的要求，还具有清热、利尿、调节胃酸的功效，为糖尿病、肥胖症、高血压、心脏病等患者提供了不诱发病情的甜味代糖品，因此近年来在食品和医学中得到广泛应用。甜菊糖有着广阔的发展前景，但目前准确而又简单易行检测方法尚未建立，现阶段用于分析甜菊糖甙含量的方法主要有容量法、重量法、流动注射化学发光法、分光光度法、毛细管电泳法、高效液相色谱法、薄层色谱法，现将这些方法的基本情况综述如下。

1 测定方法

1.1 高效液相色谱法

高效液相色谱法是以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。国标8270-1999中规定高效液相色谱仪的条件选择为：

色谱柱：-NH2基柱；流动相：乙腈∶水=80∶20；流速：1.2 mL/min；检测：紫外检测器、波长210 nm；

进样量：15µL。Tomas Vanek[3]等采用反相色谱法对甜叶菊糖进行了分离，彭启华[4]采用了反相高效液相法测定甜菊糖甙的含量在43.80%～60.39%。刘超[5]等用高效液相测得甜叶菊糖中的Stevioside和Rebaudioside A的回收率分别是98.61%、97.40%；检出限分别是0.3ng/L、4.7ng/L。其所用色谱仪条件选择如下(品种未提）：

色谱柱：Kromasi1 NH2柱(250mm×4.6mm，5µm)；流动相：V(乙腈)∶V(水)=75∶25；柱温：30℃；流速：0.6mL/min；进样量：20µL；DAD检测：210～400nm。

吴岩[6]等用DNA检测器对粗甜菊糖中甜菊苷进行测量，其线性范围50～3000µg，平均回收率为99.5%，其含量的平均值为0.358%。

1.2 薄层色谱法

薄层色谱(thin1ayer chromatography)常用TLC表示，又称薄层层析，属于固-液吸附色谱。是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。一方面适用于小量样品(几到几十微克，甚至0.01µg）的分离；另一方面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分离多达500mg的样品。王圣刚[7]等用薄层层析法对甜叶菊种子中是否存在甜菊糖甙进行了研究，结果发现甜叶菊种子中含有甜菊糖甙。

陈慕英[8]等利用氯仿∶甲醇∶水(35∶20∶1)将甜菊提取液在硅胶G板上展开，然后洗脱，蒽酮-硫酸显色，最后在620nm处测出了甜菊甙单体含量。施荣福[9]等以氯仿∶甲醇∶水(30∶20∶4)为展开剂、50%H2SO4为显色剂，在350nm显色波长下成功地将甜菊糖甙的主要组分进行了分离。此方法能快速分离测定不同组分，但对含量的测定还不够精确。

1.3 毛细管电泳法

毛细管电泳是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。毛细管电泳主要有以下几类：(1)毛细管区带电泳；(2)毛细管凝胶电泳；(3)胶束电动毛细管色谱；(4)亲和毛细管电泳；(5)毛细管电色谱；(6)毛细管等电聚焦电泳；(7)毛细管等速电泳。邵寒娟等[10]利用毛细管区带电泳快速分离测定了甜菊糖甙，分离体系选择50mmo1/L的Tris-硼砂；缓冲液选用pH=8；进样量为2psi×s；电压选择为25kV；柱温选择30℃；得到甜菊糖甙的线性范围为0.5～7.0mg/mL。优化条件下，得到甜叶菊提取物中的甜菊糖甙占干叶重5.48%，回收率为95.69%～100.48%。Liu J[11]等利用该方法分离测定甜菊糖苷的含量，测得其线性范围是0.010～2.000mg/mL，检出限是0.010mg/mL。这一方法具有以下优点.1)较好的分离效果；2)需要较低的成本；3)实验材料的用取量少。

1.4 流动注射化学发光法

在NaOH碱性介质中，Fe(CN）6-3可以直接氧化甜菊糖甙产生强的化学发光。甜菊糖甙在水溶液中没有荧光。当加入铁氰化钾后，在NaOH中产生较强荧光现象。杨丹[12]结合流动注射分析技术，提出了一种直接化学发光测定甜菊糖甙的新方法。基本操作为取甜叶菊叶片，105℃下干燥30min后80℃下干燥5h，称重研细，无水乙醇提取、振荡过夜。次日10000r/min离心10min，取出上清用无水乙醇定容到100mL。用化学发光方法在线性范围内测定，重复3次。其测定甜菊糖甙的线性范围为0.05～10mg/mL，检出限为0.05 mg/mL，回收率为98%。杨丹用此方法测得甜叶菊干叶片中甜菊糖甙的含量为9.28%，此方法操作简单，成本低，但精确度低。

1.5 分光光度法

分光光度法是根据物质对光都有其特定的吸收波长或波长范围，根据光吸收对物质进行定性定量测定的一种方法。甜菊糖甙在酸性蒽酮试剂中定量地水解成葡萄糖，葡萄糖与蒽酮反应，在乙醇介质中形成黄色络合物。此反应容易受酸度影响。黄海水[13]等用72型分光光度仪，在最大吸收波长445nm处，用不同浓度的葡萄糖溶液作出标准曲线，通过计算得出甜菊糖甙的含量。韦业成[14]将烘干的甜叶菊叶置于索氏提取器中，用甲醇提取糖甙，经过脱色、沉淀、溶液分配等获得的糖甙与蒽酮在酸性条件中加热，所得的绿色络合物，用72型分光光度计在620nm下比色测定，韦业成[6]用此方法测得总的甜菊糖甙为含量11.5%；项秀珠[15]等用甜菊糖甙酸解后与蒽酮反应液，在波长622nm处有最大吸收峰，对甜菊糖甙混合物进行测定，得其回收率均在95%以上，甜菊糖甙的总含量为11.76%。

1.6 容量法

甜菊糖甙的酸解产物-异甜菊醇具有羧基，能与碱溶液反应，从而根据酸碱滴定容量关系可计算出甜菊糖甙的含量。国标法8270-1999中取定量甜菊糖甙样品，通过加热酸解后用氢氧化钾乙醇标准溶液滴定，同时做一空白试验。测得甜菊糖甙的含量可按下式计算：

c-氢氧化钾乙醇标准溶液的实际浓度，mo1/L；

V-氢氧化钾乙醇标准溶液消耗的体积，mL；

V1-空白试验氢氧化钾乙醇标准溶液消耗的体积，mL；

804.86 -甜菊糖甙的分子量；

m-样品的质量，g。

1.7 重量法

重量法是基于甜菊糖甙中的多种糖甙在酸性溶液加热水解成非糖配基(甙元），非糖配基(甙元）能与2，4-二硝基苯肼生成苯腙沉淀，然后根据下式：

结合分子量关系计算得出甜菊糖甙含量[16]，其中1.611是甜菊糖甙与其配基异构体二硝基苯腙的分子量比值。

2 小结

综上所述，在化学分析法中，主要利用甜菊糖甙酸解后的物质与酸碱反应进行定量测定，由于界限不是十分明确，影响测定，易产生较大误差。仪器分析中，分光光度法测定的是甜菊糖甙总甙量，不能更好地鉴定分离甜菊糖甙各种成分。毛细管电泳法出结果时间短，但前期处理耗时太长，另外对仪器要求高，操作精细，不利于甜菊糖甙的快速测定。薄层层析在对于甜菊糖甙的定性测量中十分有效，能迅速测其有效成分，但在甜菊糖甙的含量测定中需要借助于薄层色谱仪，薄层色谱测定法较高效液相色谱法测定速度快，花费低，而高效液相色谱法较为准确，在实验过程中，二者可以结合使用，薄层色谱法作为一个初步的筛选过程，高效液相色谱法做更深入的测量。

综合各种因素，从测量的时间、精度以及成本进行综合比较可以看出，高效液相色谱是目前应用最为普遍的一种测定方法，因为它可操作性强，有多种可配检测器，可检测多种样品，具有高效，准确，快速，简单，易操作等优点。

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Determination Methods of Stevioside

YU Cong-min，SHI Yan (Key Laboratory of Drought-resistant Technology,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China)

The methods for the determination of stevioside were summarized.The advantages and disadvantages of the methods were compared.The most important approach between the methods is the high performance 1iquid chromatography.

Stevia rebaudiana Bertoni;Stevioside;Determination methods

杂566.9

A

1007-2624(2009）01-0065-03

2008-03-04

于聪敏(1984-），女，在读硕士，主要从事作物栽培生理研究。

石岩，E-mai1.yanshi@qau.edu.cn