不同产地龙胆中环烯醚萜类成分的含量测定

王立明

(山东省泰安长城中学，山东泰安271000)

龙胆(Radix et Rhizoma Gentianae)，又名龙胆草，因其“叶如龙葵，味苦如胆”而得名。为龙胆科植物条叶龙胆(Gentiana manshurica Kitag)、龙胆(Gentiana scabra Bge)、三花龙胆(Gentiana triflora pall)或坚龙胆(Gentiana rigescens Franch)的干燥根及根茎，始载于《神农本草经》，列为中品，性寒，味苦，入肝、胆经，具有清热燥湿、泻肝胆火的功效［1］，是中医治疗肝胆疾病的常用药之一。在临床上，龙胆是龙胆泻肝汤、当归龙荟丸、泻青丸等方剂的主药，在我国南北各地均有分布。

龙胆中的主要化学成分包括裂环环烯醚萜及其苷类、生物碱、三萜类、黄酮类等化合物，其中环烯醚萜苷类成分是其中含量最大、活性最强的部分，包括龙胆苦苷(gentiopicroside，GTP)、獐牙菜苦苷(Swertiamarian，SWT)、獐牙菜苷(Sweroside，SWS)［2-3］。目前主要通过测定药材中龙胆苦苷的含量来控制药材的质量，但只用龙胆苦苷作为指标难以反应出药材中其它环烯醚萜苷类成分的含量及龙胆药材的质量。本试验分别建立了紫外法测定龙胆药材中环烯醚萜总苷类成分含量和HPLC法测定3种环烯醚萜苷类成分含量的方法，并对21种不同产地的龙胆药材质量进行了比较，从而为龙胆药材质量的评价和质量标准的制定提供依据。

1 仪器与试药

UV-2401 PC型紫外分光光度计(SHIMADZU，Japan);Agilent 1 100型高效液相色谱仪(Agilent Technologies，USA);KUDOS SK5200LH 超声仪(上海科导超声仪器有限公司);DJ-04型粉碎机(上海淀久中药机械制造有限公司);BS224S型电子分析天平(Sartorius，Germany)。

龙胆苦苷对照品(批号110770-200510)和獐牙菜苷对照品(批号111742-200501)均购自中国药品生物制品检定所，獐牙菜苦苷对照品购自江西本草天工科技有限公司，HPLC测定含量≧98%。

所用甲醇和乙腈均为色谱纯(TEDIA，USA)，超纯水(Millipore Simplicity®水纯化系统，USA)，其余试剂均为分析纯。

龙胆药材收集于全国不同地区，详见表4。药材经复旦大学药学院侯爱君教授鉴定，均为龙胆科植物条叶龙胆(Gentiana manshurica Kitag)、龙胆(Gentiana scabra Bge)、或坚龙胆(Gentiana rigescens Franch)的干燥根及根茎。

2 方法与结果

2.1 紫外分光光度法测定龙胆总苷的含量

以龙胆苦苷为对照品，测定龙胆药材中龙胆总苷的含量。

2.1.1 对照品溶液与供试品溶液的制备

精密称取经减压干燥的GTP对照品9.90 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀作为对照品溶液;取龙胆药材粉末(40目)约200 mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，加体积分数为80%甲醇50 mL，密塞，精密称定，超声提取30 min，放冷，而后用体积分数为80%甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得供试品溶液。

2.1.2 吸收波长的确定

供试品与对照品溶液均以甲醇溶液为空白对照在200～400 nm波长处进行扫描，发现二者均在206 nm和270 nm处有吸收峰，且在270 nm处为最大吸收，样品溶液在270 nm处样品吸收干扰较小，故选择270 nm作为测定波长。

2.1.3 标准曲线及线性范围

精密吸取对照品溶液 0.4，1.0，2.0，3.0，4.0 mL至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度。以甲醇为空白，于270 nm波长处测定吸收度值A，以A对浓度C作线性回归，得标准曲线方程:A=0.024 8C-0.004 1(r=0.999 9)，表明在 3.96 ～39.6 μg/mL内线性关系良好。

2.1.4 精密度试验

取对照品溶液，连续测定6次，计算 RSD为0.38%。

2.1.5 重复性试验

精密称取同一批龙胆药材粉末(40目)6份，每份约200 mg，按2.1.1项下方法制备供试品溶液，分别进行测定，所得数据的RSD为1.36%。

2.1.6 稳定性试验

取同一供试品溶液在室温下放置，分别于0、4、8、12、24、48 h进样测定，计算测定结果的 RSD 值，为0.86%，表明供试品溶液在室温放置2 d稳定。

2.1.7 加样回收率试验

精密称取同一批已知含量的龙胆药材粉末(40目)9份，每份约100 mg，置于具塞锥形瓶中，分别精密定量加入GTP对照品溶液，按2.1.1项下方法制备供试品溶液，测定含量，计算高、中、低3种质量浓度的平均回收率及RSD，结果见表1。

表1 龙胆总苷测定的加样回收率测定结果

2.1.8 不同产地药材中的含量测定

取21批不同产地的龙胆药材样品，按2.1.1项方法制备供试品溶液，并进行测定。测定结果见表4。

2.2 HPLC法测定龙胆苦苷、獐牙菜苦苷和獐芽菜苷的含量［7］

2.2.1 对照品溶液及供试品溶液的制备

精密称取龙胆苦苷、獐牙菜苦苷和樟芽菜苷对照品适量，置10 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，即得混合对照品溶液，其中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷和獐芽菜苷的浓度分别约为600、10和10 μg/mL。

取龙胆药材粉末(40目)约300 mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，加体积分数为80%的甲醇50 mL，密塞，精密称定，超声提取30 min，放冷，而后用80%的甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.2 色谱条件与系统适用性实验

色谱柱:Agela Venusil XBP-C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)，保护柱:Securityguard-C18(5 μm，4.0 mm×2.0 mm);流动相:甲醇-水(17∶83);流速:1 mL/min，柱温:30℃;进样体积:10 μL;检测波长:254 nm。

分别精密吸取10 μL对照品溶液和供试品溶液进样，如图1所示，SWT、GTP和SWS的保留时间分别约为18、24和30 min，与其他组分分离较好(R＞1.5)，理论塔板数按龙胆苦苷计算应在5 000以上。

图1 龙胆药材及标准品HPLC图谱

2.2.3 标准曲线与线性范围

精密吸取混合对照品贮备液各 10、5、2.5、1、0.4 mL，分别置10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。分别取上述系列浓度的溶液及混合对照品贮备液各10 μL，注入液相色谱仪测定各成分的色谱峰面积。将色谱峰面积对质量浓度作线性回归，结果见表2。各指标成分在测定浓度范围内，线性关系良好。

表2 龙胆苦苷、獐牙菜苦苷和獐芽菜苷HPLC测定的标准曲线及线性范围

2.2.4 精密度试验

分别吸取高、中、低3种浓度的对照品溶液，测定并计算其日内与日间精密度，日内精密度每份样品进样5次，日间精密度每份样品每天测定1次，连续5 d。结果GTP、SWT和SWS的日内精密度RSD(n=15)分别为0.76%、0.90%和0.91%，日间精密度RSD(n=15)分别为1.10%、1.24%和1.56%。

2.2.5 重复性试验

取同一批次龙胆药材5份，按2.2.1项下方法制备供试品溶液，分别进样并计算含量。结果3种组分的RSD分别为1.42%、1.03%和1.67%。

2.2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液在室温下放置，分别于0、4、8、12、24、48 h进样分析并计算含量。结果獐芽菜苦苷、龙胆苦苷和獐芽菜苷的RSD分别是0.859%、0.783%和1.296%，表明供试品溶液室温下2 d内稳定。

2.2.7 回收率实验

精密称取已知含量的样品，共9份，分别精密加入GTP、SWS及SWT对照品溶液，按2.2.1项下方法制备供试品溶液，测定含量，计算高、中、低3种质量浓度的平均回收率及RSD，结果见表3。

表3 龙胆苦苷、獐牙菜苦苷和樟芽菜苷HPLC测定的加样回收率(n=3)

2.2.8 不同产地龙胆样品的含量测定

取21批不同产地的龙胆药材样品，按2.2.1项下方法制备供试品溶液，分别进样测定，按外标一点法分别计算GTP、SWS和SWT的含量，结果见表4。

3 讨论

龙胆苦苷、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷是龙胆中裂环环烯醚萜苷类化合物的指标性成分，化学结构相似，紫外光谱的最大吸收波长分别为270、230和235 nm。为方便进行测定，参考相关文献［4］，故本实验选择254 nm为检测波长，方法学研究结果显示，均符合要求，可以满足同时测定3种成分的要求，效果良好。

表4 不同产地龙胆药材中龙胆总苷及3种成分的质量分数(%)(n=3)

由于受产地、气候和生态环境等差异的影响，仅针对中药材或其提取物的某个有效成分进行定性、定量分析，并不能有效控制其质量。指纹图谱是一种较好的质量控制方法，可以提供较稳全面的信息，但不同产地之间的药材差异较大。因此，对已知的有效部位和更多的有效成分进行含量控制，就成为一种控制与评价药材质量的可行而合理的方法。本试验选择龙胆中的有效部位环烯醚萜苷类及其中3种已知成分作为指标，与现有的只测定龙胆苦苷的含量比较，可以更全面的反映出龙胆药材的质量。研究结果显示，样品的前处理和测定方法简便、可行。

《中国药典》2005年版(一部)规定，龙胆药材中龙胆苦苷的含量不得少于1.0%。从测定结果看，21种不同产地的龙胆药材中，只有4种达不到此要求，约占总数的20%。但不同产地药材中有效部位及3种有效成分的含量差异较大，东北产龙胆中环烯醚萜苷类成分的含量相对较高，这与张建生［4］等人的测定结果基本一致。而且，另外，本实验对龙胆苦苷与龙胆总苷含量的相关性进行统计分析，发现二者具有良好的相关性，相关系数达0.985 8，说明通过测定药材中龙胆苦苷的含量可以在一定程度上反映出龙胆总苷的含量，说明了以龙胆苦苷作为龙胆药材质量控制指标的合理性。

［1］中国药典［S］.一部.2005:64-65.

［2］刘 涛，才 谦，付玉芹.中药龙胆的研究进展［J］.辽宁中医杂志，2004，31(1):85-86.

［3］刘 涛，付玉芹，才 谦，等.龙胆总裂环环烯醚萜苷质量标准研究［J］.云南中医学院学报，2006，29(2):25-27.

［4］张建生，田子新，楼之芩.九种龙胆中五种裂环环烯醚萜苷类苦味成分的高效液相色谱定量分析［J］.药学学报，1991，26(11):864-870.