人工感染雏鸭体内DEV强毒的荧光定量PCR检测*

杨 颖,夏 梦,殷俊磊,毛君婷,杜海燕,周碧君,文 明*

(1.贵州大学动物科学学院,贵州贵阳510000;2.湘西自治州种畜场,湖南吉首416000)

鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis,DVE)又称鸭瘟(Duck plague,DP),是由鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)引起鸭、鹅和其他雁形目禽类的一种急性热性败血性传染病,其特征是血管损伤、体腔溢血、消化道出血、坏死、淋巴器官受损和实质器官退行性变化等[1-2]。本病自1923年首次报道以来,广泛流行于养鸭国家和地区,具有较高的发病率和死亡率,给养鸭业造成了巨大的经济损失[3-5]。

DEV为疱疹病毒科禽疱疹病毒Ⅰ型成员,对感染宿主体内各器官组织具有泛嗜性。近年来,许多学者对DEV的形态发生学、快速检测方法以及分子生物学等方面进行了大量的研究,并取得了较大的进展;同时也采用多种方法进行了DEV在感染鸭体内的分布规律研究,但对DEV的致病机理尚未完全阐明[6-10]。实时荧光定量PCR是近年来发展较快的一种PCR技术,具有较高的特异性和敏感性,可以实现定量检测的目的[11-12]。本试验根据实时荧光定量PCR的特点,选用SYBR GreenⅠ模式,对人工感染雏鸭体内的DEV动态分布规律进行了检测研究,以期为DEV的致病机理和病理诊断技术研究提供一些理论依据和试验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株与试验用动物 试验用毒株为鸭肠炎病毒强毒GZ株,由笔者所在实验室鉴定保存。试验用鸭为不含DEV抗体的15日龄健康雏鸭,购自贵阳某鸭场。

1.1.2 主要试剂和仪器 Universal Genomic DNA Ex traction Kit Ver.3.0(DV 811A)及SYBR·Premix Ex TaqTM(DRR041A)购于宝生物工程(大连)有限公司;FQD-48 Line-Gene 3000实时定量PCR仪,为杭州博日有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据GenBank上DEV-NP基因序列(登录号:DQ072725)的保守区域,设计并合成一对特异性引物,即上游引物为N1:5′-CGTCAACGCTATGCTACCATC-3′,下游引物为N2:5′-CATCTGCCATCACCAGTTCTG-3′,理论扩增片段大小为335 bp,引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.2.2 SYBRGreenⅠPCR标准曲线的建立 按试剂盒方法提取DEV强毒GZ株的病毒DNA后,取适量DNA模板做连续10倍倍比稀释(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7),以不同稀释度的DEV DNA样本为模板进行SYBR Green IPCR反应,建立荧光定量PCR标准曲线。病毒DNA模板拷贝数的计算公式为:模板拷贝数=(DEV DNA模板浓度×阿氏常数)/(碱基平均分子质量×DEV DNA模板总长度),其中DNA浓度通过测定OD260nm值后计算得到;阿氏常数为6.02×1023;碱基平均分子质量为660 u;DEV DNA模板总长度约为150 kb。

PCR采用25.0μL反应体系,按(DRR041A)使用说明书添加,即SYBR·Prem ix Ex TaqTM(2×)12.5μL、上/下游引物(10μmol/L)各0.5μL和模板DNA 2.0μL,最后补ddH 2O至25μL。反应条件为95℃30 s、95℃5 s和60℃30 s,共40个循环;每个循环结束后,于60℃收集荧光信号1次,绘制DNA模板的扩增曲线和荧光定量PCR反应的标准曲线。

1.2.3 雏鸭人工感染及样品采集 将60只15日龄雏鸭随机分成2组,第1组为人工感染组计36只,采用腿部肌肉注射接种DEV病毒液,0.1mL/只;第2组为空白对照组计24只,不进行任何处理,隔离饲养。于第3、6、10、18、30、48、72、96、108 h(死亡)剖杀雏鸭,无菌采集脑、肝、脾、肾、十二指肠、胸腺、胸肌、盲肠、心、肺等组织样本(其中每个时段人工感染组剖杀3只鸭,空白对照剖杀2只鸭)分别编号并装于灭菌平皿,置-80℃保存备用。

1.2.4 感染雏鸭体内组织中病毒DNA的SYBR G reen IPCR检测 无菌分别称取上述采集的雏鸭组织样品,于研钵(每个样品一个研钵)充分研磨后,加入ddH 2O(按1 g样本2mL PBS缓冲液)混匀,倒入无菌Eppendorf管中,3 000 r/min离心10 m in,取上清液200μL,按Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(DV 811A)使用说明书提取DEV DNA,取2.0μL作为SYBRG reenⅠPCR的反应模板,按上述方法进行SYBR GreenⅠ模式Real-time PCR扩增,检测各组织中DEV DNA含量。

2 结果

2.1 SYBRGreenⅠPCR标准曲线的制作

选取DEV DNA的6个稀释度(10-2～10-7)作为模板同时进行Real-time FQ-PCR扩增,结果可见PCR扩增曲线呈典型的S型,且指数增长期、线性增长期和平台期明显(图1);调整增阈值与基线配比,确定Ct值,转换得出SYBR GreenⅠ模式Realtime PCR标准曲线(图2),经计算线性循环数与DNA模板浓度的相关系数达0.999,表明本试验建立的SYBRGreenⅠPCR检测误差较小,可以用于临床样本的检测。

图1 不同稀释度(10-2～10-7)DNA模板的Real time PCR扩增曲线Fig.1 Real-time PCR amplification curve of the different diluted DNA

图2 实时荧光定量PCR标准曲线Fig.2 The standard cu rve of Real-time FQ-PCR

2.2 DEV强毒株在人工感染雏鸭体内增殖规律的检测结果

以DEV强毒经腿部肌肉注射15日龄雏鸭,在感染后不同时间剖杀,采集雏鸭不同组织提取病毒DNA样本,应用建立的SYBR Green I模式Realtime PCR进行定量检测,结果显示,感染后3 h即可在肝、脾、脑、胸腺、肾和肺等6种器官组织中检出DEV核酸;感染后6 h,除上述组织外还可在十二指肠和盲肠中检测出病毒核酸;感染10 h后又可在心肌和胸肌中检出,而空白对照组鸭各个受检样品在不同时段上,均呈阴性反应(图3)。同时发现,不同受检组织在感染时间内DEV DNA含量有所不同,总体趋势(由高到低)为脑、肝、脾、胸腺、肾、十二指肠、盲肠、肺、胸肌和心肌。

图3 人工感染鸭各组织中DEV的动态分布Fig.3 Dynamic distribution of virus in tissues of ducks infected with DEV

3 讨论

鸭病毒性肠炎(鸭瘟)是危害水禽养殖业健康发展的重要传染病之一,许多学者对其病原鸭肠炎病毒(DEV)进行深入研究,取得了较大的进展;也有部分学者采取免疫组化、普通PCR等实验技术对感染鸭体内DEV的分布规律进行了研究[6-10],但对DEV的致病机理尚未得到完全的阐明。实时荧光定量PCR是近年来发展起来的一种新型PCR技术,与普通PCR技术相比,可以实时观察扩增结果,避免了普通PCR的电泳与染色过程,减少了交叉污染的可能性,并且可以定量检测,整个过程约需3.5 h,具有简单、准确、快速等优点,故很快得到广泛的应用,如病原快速鉴定、DNA拷贝数检测、单核苷酸多态性(SNPs)分析以及m RNA表达研究等。因此,也有部分学者应用实时荧光定量PCR对DEV的增殖、分布及排泄等方面进行了研究[13-15]。

本试验利用实时荧光定量PCR的特点,采用SYBR GreenI模式PCR检测人工感染雏鸭体内DEV强毒的动态分布,结果发现DEV含量在感染雏鸭体内的分布时间具有一定的规律性,即较早检出病毒DNA的是肝、脾、脑、胸腺、肾和肺组织,其病毒含量也相对较高,而其他组织检出时间相对晚些,且病毒含量也相对较少。这可能由于经肌肉注射感染后,DEV通过血液循环首先达到肝后,再经血液循环散布到全身各处组织器官。这与Yuan G P等[16]对DEV强毒感染后鸭组织器官的电镜观察结果基本一致。从感染鸭组织器官中的病毒含量看,在肝、脾和脑中相对较高,且检出时间也较早,提示这些器官组织是DEV的主要靶器官,也是进行病毒分离与检测的最佳采样部位。上述结果显示,进行感染动物体内进行病毒增殖与分布动态变化的定量检测,对揭示病毒的致病机理及病毒与机体间相互作用是十分必要且非常有用的[17-18]。

本试验还发现,感染后3 h即可在感染雏鸭肝、脾、脑、胸腺、肾和肺等6种组织中检出DEV DNA;而一般在感染后36 h雏鸭才开始表现出一定的临床症状,如精神沉郁、食欲减退、体温升高等。由此可见,应用SYBR Green I模式实时荧光定量PCR技术,可及时对染病家禽及其产品进行检测,有利于DEV疫情的早期发现和有效控制。

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