12种中药的体外抑菌试验*

黄 玲,林居纯,马 驰,钟钦卿

(四川农业大学动物医学院,四川雅安625014)

一直以来,我国兽医临床主要使用抗菌药控制细菌感染。随着抗生素的广泛使用,所带来的毒性反应、兽药残留及耐药性等问题日显突出。针对抗生素所带来的问题,兽医临床急需寻找低毒有效的抗菌药物替代品,以控制疾病的发生。国内外的研究显示[1-2],中药或天然植物提取物,可发挥对病原菌直接杀灭作用或提高机体免疫力达到防治疾病效果。本试验选用蒲公英等12味中药,对大肠埃希菌等3种标准菌,以及30株不同临床分离菌进行了体外抑菌作用研究,旨在筛选出对临床耐药菌株有抑菌作用的药物,为指导临床用药和进一步进行中药逆转细菌耐药性研究提供基础工作。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 中药 蒲公英、五倍子、乌梅、黄连、黄芩、金银花、大黄、秦皮、穿心莲、白头翁及苦参,购自四川省雅安市惠民堂药店;木耳购自雅安市苍坪山农贸市场。

1.1.2 供试菌株 标准菌株:金黄色葡萄球菌ATCC25923,大肠埃希菌ATCC25922,沙门菌C79-13;临床分离菌株:金黄色葡萄球菌(耐磺胺类药物)10株(SA 1～SA 10)、大肠埃希菌(耐阿莫西林和耐四环素)10株(E1～E10)、沙门菌(耐喹诺酮类药物)10株(S1～S10),由四川农业大学药学实验室保存提供。

1.1.3 仪器与试剂 超净工作台(苏净集团安泰公司);SPX型生化培养箱(宁波东南仪器有限公司);微量移液器(德国Eppendorf公司);营养琼脂、MH琼脂、MH肉汤购自杭州微生物试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 药液的制备 称取洁净干燥药材剪碎后置于烧杯中,加蒸馏水没过药材1 cm左右,浸泡20 min后加10倍于药材量的水,置于电炉加热,煮沸30 min后用纱布过滤,再加5倍于药量的水没过滤渣,煮沸30m in后过滤,将两次滤液合并浓缩至1 g/mL,流通蒸汽灭菌20 min,放入4℃冰箱备用。

1.2.2 菌液的制备 将大肠埃希菌ATCC25922等3株标准菌和30株临床分离菌在营养琼脂平板上画线培养后,挑取单个菌落接种于MH肉汤中培养12 h～16 h,作为原菌液。

1.2.3 MH平板的制备 将灭菌后的MH琼脂培养基倾注至无菌平皿,待培养基冷却后形成厚度为4mm的平板。制成的MH平板取出一个置37℃温箱培养24 h做无菌试验,其余用密封袋封好置4℃冰箱保存,7 d内用完[3]。

1.2.4 抑菌试验 采用管碟法。用无菌棉签蘸取浓度为105cfu/mL～106cfu/mL的细菌稀释液,涂布于MH平板上,用无菌镊子将钢管均匀摆放平板上,静置10 m in～15m in,滴加中药药液,加至液面与钢管表面平行即可[4]。将平板37℃培养12 h～18 h后,用游标卡尺测量抑菌圈大小。

1.2.5 试验结果判定标准 试验结果判定标准:抑菌圈直径大于20 mm为高度敏感,10 mm～19mm为中度敏感,小于10 mm为不敏感[5]。

2 结果

2.1 12种中药对标准菌株的抑菌效果

12种中药中木耳、穿心莲、白头翁、苦参对标准菌株无抑菌作用;其余8种中药对3种标准菌株表现出不同程度的抑菌效果(表1)。

2.2 12种中药对临床菌株的抑菌效果

12种中药中除木耳、穿心莲、白头翁、苦参对临床分离菌株无抑菌作用外,其余药物均有抑菌作用。其中五倍子、乌梅对不同种类的30株临床菌株均表现出高度敏感;黄连,蒲公英分别对金黄色葡萄球菌和沙门菌表现出高度敏感;其余药表现为中度敏感(表2)。

表1 不同中药对标准菌株抑菌效果Table 1 Bacteriostatic effect of different Chinese herbalm edicines on standard bacteria

表2 不同中药对不同临床菌株抑菌效果Table 2 Bacteriostatic effect of different Chinese herbal medicines on different isolates

3 讨论

体外抑菌试验方法有二倍稀释法、纸片法、管碟法、打孔法等。有研究表明二倍稀释法操作繁琐,且药液颜色不易观测。打孔法因中药液黏稠度大,以至滴在孔内的药液难以扩散,故以上两种方法都有局限性。管碟法和纸片法技术上虽简单易行,但纸片所吸附的药量不好确定,且吸附到纸片上的药液又不易扩散,故影响药物的抑菌效果[6]。而管碟法取量精确,试验结果较为准确且有规律,故本试验采用此方法进行抑菌试验。

试验发现,木耳、穿心莲、白头翁、苦参4味药对标准菌和临床分离菌均无抑菌活性。木耳现多研究其对免疫功能的影响[7],而无抑菌作用的报道,本试验选取木耳依据是其熬制的汤久置不腐败。关于穿心莲[8-9]、白头翁[10-11]、苦参[12-13]抑菌活性的报道不一,本试验中穿心莲、白头翁、苦参均无抑菌活性,其原因有待进一步研究。另外,试验结果判定标准不同也可能是抑菌效果不一致的原因,因此笔者认为应尽快为中药抑菌试验结果确定统一的判定标准。

由试验结果可知,蒲公英等8味中药对3种细菌均有一定的抑制作用,其中蒲公英、五倍子、乌梅、黄连、金银花抑菌活性较强。本试验中蒲公英、金银花1 g/mL的水煎剂对细菌均有抑制作用,与其他报道基本一致[9,14]。五倍子中抑菌成分多认为是鞣质,但有研究表明提除鞣质后仍有抑菌作用[8],其具体抑菌机理有待研究。乌梅酸性极强,其抑菌作用是否与酸性有关,还有待研究。对黄连的杀菌作用研究得较成熟[15],其机理主要是抑制微生物糖代谢。

本次试验结果显示8味中药对标准菌和临床分离菌均有抑制作用,虽然抑菌圈大小有一定差异,但经t检验差异无显著性(P＞0.05),提示8味中药均有很好的应用前景,故可进一步开展消除细菌耐药性的研究。另外,鉴于中药同时作用于细菌和动物机体以发挥疗效,可以进行8种中药的体内抑菌活性研究,以便更好地指导临床用药。

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