鸭疫里氏杆菌的分离与16 S rRNA的鉴定

冯金牛,阮二垒,杨丽云,黎丁滔,陈瑞爱,王林川,*

(1.华南农业大学兽医学院,广东广州510642;2.广东省大华农动物保健品股份有限公司,广东新兴527400)

鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)病是危害水禽养殖业(特别是养鸭业)的重要疫病之一[1]。家禽中鸭最易感,其中樱桃谷鸭、番鸭、麻鸭、丽佳鸭等多个品种的鸭均可发病[2]。本病呈急性或慢性败血症过程,以纤维素心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎为特征,部分病例还出现干酪样的输卵管炎、关节炎。

1904年,Reiemer首次发现该病(当时称为“鹅渗出性败血症”)以来,世界各地相继报道了该病的流行。国外报道该菌至少有21个血清型[3],不同血清型之间的几乎没有交叉保护[4]。2003年,程安春等[5]对我国分离并鉴定出的1 842株鸭疫里氏杆菌进行了血清学调查,结果有15个血清型,其中有4个新血清型的出现,这样使本来血清型复杂的RA的鉴定和预防变得更加困难。在临床和病理变化上,RA的感染和鸭大肠埃希菌病、鸭沙门菌病很难区别,一般出现两种或两种以上细菌混合感染,所以在临床诊断上有很大的困难。RA的血清型众多,同时还有新的血清型出现,国内市场还没有全套商品化的阳性血清;传统的细菌分离鉴定也很难达到鉴定RA的目的。本试验根据GenBank发布的RA1-19型16 S rNA的保守基因序列设计并合成一对引物,建立快速检测RA的PCR方法,并用该方法对疑似病料进行检测鉴定,为本实验室对RA进行分子流行病学调查奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2009年8月到10月广东省云浮市和惠州市的肉鸭养殖场暴发疑似鸭疫里氏杆菌病,送检我们实验室6只病死雏鸭,无菌采集肝脏、心脏、脑等12份病料。

1.1.2 主要试剂及仪器 细菌生化鉴定管为杭州天和微生物试剂有限公司产品;麦康凯培养基、TSA(T ryptic Soy Agar)和TSB(Tryptic Soy Bronth)为北京陆桥技术有限公司产品。细菌基因组DNA提取试剂盒为天根生化科技有限公司产品,ExTaqTMDNA聚合酶、dNTPs(each 10 mmol/L)、Mix均为宝生物工程(大连)有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物 根据GenBank中发表的鸭疫里氏杆菌(RA)1-19型16 S rRNA基因序列分别与大肠埃希菌、沙门菌、葡萄球菌、巴氏杆菌的16 S rRNA基因序列比对设计特异性引物:P1:5′-CTGAACACGGTGTACGAATAAG-3′;P2:5′-TCTTATACGAGTCCCCAAC-3′。扩增的片段长度为680 bp,引物由上海基康生物技术有限公司合成。

1.2.2 分离培养 将无菌采集的病料分别划线接种到TSA和麦康凯培养基上,置于37℃恒温培养24 h,选择可疑菌落进行染色镜检。

1.2.3 分离菌的鉴别培养及纯化 根据菌落的形态特征及染色特性对可疑菌落在TSA和麦康凯培养基进一步纯化培养24 h[6],直到培养基上培养的为单一菌落,并进行染色镜检观察染色特性。

1.2.4 生化试验 取单菌落分别接种于5 mL TSB培养基,37℃恒温摇床中培养24 h,镜检无杂菌后分别取10 μ L～20 μ L,参考杨宗维等[7]介绍的方法进行生化鉴定,然后根据生化鉴定管说明书要求的不同时间观察并记录结果。

1.2.5 PCR扩增及测序 根据生化试验结果,选取6株进行PCR扩增:①取单菌落接种于5 mL TSB液体培养基,37℃恒温摇床中培养24 h,镜检无杂菌后按照革兰阴性菌提取试剂盒提取细菌基因组。②目的片段的扩增及测序:采用25 μ L体系,10 μ L Mix,2 μ L模板,上下游引物各0.5 μ L,三蒸水12 μ L。反应程序为94℃30 s;94℃5 min,52℃30 s,72℃1 min,30个循环;72℃延伸10 min。产物电泳后按照胶回收试剂盒说明进行胶回收,然后将PCR纯化产物送北京华大公司测序。③序列比较,将测序结果放入GenBank中进行相似性检索,对结果进行分析。

1.2.6 动物回归试验 用TSA上培养纯化的细菌,并用无菌生理盐水制备成菌悬液(3.5×109cfu/mL),皮下接种于6只14日龄的健康雏鸭,0.5 mL/只[8],连续观察7 d,记录发病及死亡情况,并对死鸭进行细菌的分离鉴定。

2 结果

2.1 培养及染色特性

分离到的6株RA,在TSA上生长24 h后形成圆形微凸起,湿润,光滑灰白色1 mm～2 mm大小的菌落,用折光观察菌落带有蓝色虹光;在麦康凯琼脂培养基不生长。菌体呈杆状或椭圆状,大小0.3 μ m～0.5 μ m×0.7 μ m～6.5 μ m,偶见个别长丝状,长11 μ m～24 μ m。多数为单个,少数成双或短链排列。革兰染色阴性。

2.2 生化鉴定结果

将分离到的6个菌株纯培养物分别接种于如上表的各种生化反应管,除了精氨酸双水解酶全部阳性,氧化酶阳性的有5株细菌,有3株液化明胶;其他的生化反应均为阴性(表1)。

表1 分离株的生化反应结果Table 1 The biochemical reaction results of isolates

2.3 PCR结果及测序

扩增完毕后用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,以DNA Marker DL 2000 plus为分子质量标准,可见680 bp左右的特异条带(图1)。将所得到的序列与GenBank中已知的RA16 S rRNA序列进行比对,同源性达到99.99%。

2.4 动物回归试验

攻毒24 h后开始出现早期临床症状,不愿行走,少食,拉黄白色稀粪,眼睛周围有黏性分泌物;48 h～72 h出现神经症状。摇头,扭颈,头颈震颤。72 h死亡60%,168 h全部死亡。剖解病变主要以心包炎,肝周炎,气囊炎,脑膜炎为主。心脏体积增大、心包液增多,在心包外膜覆盖一层灰白色纤维素薄膜;肝脏、脾脏肿大,钝圆,表面淡白色纤维素薄膜;胸、腹部气囊混浊,表面有点状淡黄色纤维素碎块黏着表面,逐渐钙化(图2)。能够从死亡雏鸭的肝、血液和脑中分离出相同的细菌。

图1 PCR检测结果Fig.1 Results of PCR detection

图2 肝脏和心脏的病理变化Fig.2 Pathological lesions in liver and heart

3 讨论

通过细菌的分离培养,染色镜检,生化反应,以及动物回归实验等传统细菌分离鉴定方法和利用16 S rRNA保守序列设计特异引物PCR扩增方法,都可以鉴定分离到是鸭疫里氏杆菌。但是相比之下,传统的生化鉴定试验繁杂而且准确性较差。本试验通过生化鉴定确定为RA,随机取一株进行分子生物学鉴定,所得到的序列通过在GenBank中比对,结果发现其与GenBank上发布的RA的16 S rRNA的同源性达到99.99%,李永峰等[9]根据Matsuki的研究,凡是16 S rRNA序列的同源性大于97%便可认为是同一种细菌。近年来,随着核酸测序技术的不断普及,利用PCR技术对细菌保守区域进行扩增,然后将所得的序列与GenBank中已知序列比对已成为细菌的快速鉴定方法,而且通过与已知细菌16 S rRNA全序列进行同源性比较,能够鉴定到属级。曲丰发等[10]设计了一对鸭疫里氏菌16 S rRNA基因的特异性引物190f和843r,分别以基因组DNA和菌落提取液为模板均能扩增出大小为654 bp的特异性片段,基因组DNA的最小检出量为50 pg,菌落最小检出量为15 cfu/mL;杨苗等[11]建立了基于鸭疫里氏杆菌16 S rRNA PCR检测方法,只有RA DNA能扩增出844 bp的特异性条带,其他细菌的DNA不能扩增出任何条带,PCR对RA DNA最小检出量为22 pg,最少检出RA菌液为80 cfu/mL。本试验也是根据鸭疫里氏杆菌16 S rRNA基因的保守序列设计特异引物来快速检测RA。该方法与传统方法相比,周期短,成本低,准确性高。覃宗华等[12]利用生物软件对GenBank收录的鸭疫里氏菌和大肠埃希菌的16 S rRNA基因序列进行分析后,设计了鸭疫里氏菌和大肠埃希菌的种特异性引物,分别能从各自的16 S rRNA基因中扩增出长度为342 bp和718 bp的DNA片段。并据此建立了一种能快速准确鉴别诊断鸭疫里氏菌和大肠埃希菌病的双重PCR方法,进一步证明基于细菌16 S rRNA PCR检测方法不仅可以应用快速检测,同时也可通过构建双重或多重PCR方法可以用来鉴别诊断。本试验在生化试验的基础上,应用16 S rRNA同源识别验证,总结出一套简化的鸭疫里氏杆菌鉴定方法,为鸭疫里氏杆菌的快速鉴定提供基础。

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[12] 覃宗华,蔡建平,吕敏娜,等鸭疫里默氏菌病和大肠埃希菌病鉴别诊断双重PCR方法的建立和应用[J].畜牧兽医学报2008,39(4):517-521.