人脑胶质瘤细胞两种分离方法的对比研究

刘建熙 张鹏远 张玉杰 邓 巍

郑州大学第二附属医院 郑州 450014

胶质细胞瘤发生率较高，据文献统计，占颅内肿瘤的35.26％～60.96％，居第一位［1］。胶质瘤细胞的纯化分离培养对于离体条件下进行胶质瘤细胞的预测化学及放射敏感性实验研究具有广泛的实用价值［2］。近来也用于逆病毒介导疗法［3］和用脑肿瘤选择性肽配体靶向融合［4］的研究。实验所采集肿瘤组织来自郑州大学二附院神经外科，术后均经病理证实为胶质细胞瘤，组织学分级1级3例，4级1例。本实验对胶质瘤细胞的两种分离纯化方法进行了对比研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料D－PBSA缓冲液自行配置后高温高压灭菌；DMEM/F12（1∶1）培养基（美国HyClone公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；0.25％胰蛋白酶（美国Sigma公司）；标准筛：直径分别为1 mm和74μm（浙江省上虞市道墟张兴纱筛厂）

1.2 方法机械分离法［5］：将术中无菌状态收集的胶质瘤组织于无菌状态取一部分以D－PBSA冲洗3遍，而后用手术刀将组织切碎为3～5mm3大小，每次取几块组织放在标准筛上，筛置于9cm皮氏皿上（皮氏皿中加有培养基）。用注射器芯轻轻加压使组织通过筛孔进入培养基，吸取培养基吹过筛网将细胞冲下。吸取分离的组织加入74μm孔径的标准筛，再次过滤。用血球计数板进行细胞计数。冷胰酶消化法［5］：将剩下的肿瘤组织如前所叙，清洗、切碎后将其移入一个预先称重的15mL无菌离心管中。用D－PBSA离心清洗组织块3次（离心速度为800r/min），去除上清液，称重。每克组织加入10mL溶于DMEM/F12的0.25％胰蛋白酶，4℃放置6～18h。吸去胰蛋白酶，37℃孵育20min，加入温培养基，约以100mg的初始组织加1mL。用吹打管吹打混合物至组织完全分散开。用血球计数板进行细胞计数。

1.3 纯化计数后按约2×105/cm2接种于50 m L无菌培养瓶中，采用速差贴壁法［6］处理。

1.4 分离细胞的免疫荧光及Giemsa染色鉴定胶质瘤组织用两种方法分离后在免疫荧光显微镜下所见细胞密度差异。Giemsa染色后观察所见：图片中细胞核为紫罗兰色，核仁蓝黑色，细胞质透光发亮。可见细胞及细胞核形状、大小不一，并出现双核及多核现象。见图1、图2、图3。

图1 冷胰酶消化法所分离细胞图片200倍

图2 机械分离法所分离细胞图片200倍

图3 培养后Giemsa染色图片400倍

1.5 统计学方法采用SAS 9.1统计软件进行分析，所有计量资料用均数±标准差（±s）表示，应用配对样本t检验比较两组细胞计数的差异。检验水准取α＝0.05。

2 结果

见表1。

表1 胶质细胞瘤分离后细胞计数

3 讨论

机械分离法这种操作比冷胰酶消化法速度较快，但随着筛网孔径的变小而产生的剪切力对细胞的机械损伤也随之增加，对于较软的组织这是一种成功的方法。而冷胰酶消化法可获得较高的细胞存活数量，这是因为在4℃时胰蛋白酶活性较小，长时间的浸泡不仅胰蛋白酶可以充分渗入到组织中，而且对组织的损伤也很小，所以培养36h后生存率也较高，同时可保留较多的细胞种类。不足之处是该方法所需时间稍长，并且胰蛋白酶消化的浓度不好掌握，可能会破坏有助于细胞存活的细胞表面黏附分子、细胞基质等细胞成分［7］。机械分离法适用于较软的组织，但是悬液中存活的细胞数较少。若组织取材不受限，细胞数量无关紧要，在短时间内可产生与冷胰酶消化同样多的活细胞。然而两种方法相结合有可能会有较好的效果

目前，细胞培养已成为生命科学领域中的一项关键按技术。在体外培养条件下借助细胞超微结构的研究手段［8］，将为我们深入研究胶质细胞瘤增殖、凋亡相关的分子机制提供了新的线索和手段。在医药学领域，进行细胞治疗的关键程序即是细胞的增殖细胞的基因修饰和细胞的诱导分化等，这也需要借助细胞培养这一关键技术。可以预期，在今后的生命科学与医药学的研究中，细胞培养还将会有更广泛的应用。而细胞的分离则是细胞培养的第一步，故此选择一个合适的细胞分离方法显得尤为重要。

［1］王忠诚.神经外科学［M］.武汉：湖北科学技术出版社，2005：512－513.

［2］Thomas DGT，Darling JL，Paul EA，et al.Assay of anti－cancer drugs in tissure culture：Relationship of relapse free interval（FRI）and in vitro chemosensitivity in patients with malignant cerebral glioma［J］.Br J Cancer，1985，51：525－532.

［3］Rainov NG，Ren H.Clinical trals with retrovirus mediated gene therapy－what have we learned？［J］.J Neurooncol，2003，65：227－236.

［4］Liu TF，Cohen KA，Willingham MC，et al.Combination fusion protein therapy of refractory brain tumors：demonstration of efficacy in cell culture［J］.J Neurooncol，2003，65：77－85.

［5］Ian Frshney著.章静波，徐存栓等，译.动物细胞培养［M］.北京：科学出版社，2008：247－250；258.

［6］蒋伟，法宪恩，李晓召.乳鼠窦房结细胞的分离纯化与形态学研究［J］.医学信息内·外科版，2009，22（12）：1 075.

［7］刘永海，赵莲花，赵辉，等.大鼠胎脑皮质神经干细胞体外培养及诱导分化的实验研究［J］.中国实用神经疾病杂志，2006，9（6）：3－4.

［8］陈刚，秦尚振，马廉亭，等.人胚神经干细胞的体外培养和超微结构观察［J］.中国临床神经外科杂志，2006，11（2）：92－97.